优化的串连细胞因子及其在诱导多能性干细胞中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种优化的串连细胞因子及其将该细胞因子应用在诱导多能性干细胞中的方法。该细胞因子为Ｏｃｔ４－Ｆ２Ａ－Ｋｌｆ４－Ｐ２Ａ－Ｓｏｘ２ｏｐｔ，其中，Ｏｃｔ４、Ｆ２Ａ、Ｋｌｆ４、Ｐ２Ａ和Ｓｏｘ２ｏｐｔ的基因序列分别如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：６、ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：３和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：７、ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：４和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：８所示。Ｆ２Ａ和Ｐ２Ａ的基因序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：３和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：４所示。ｐＭＸｓ载体用于携带优化的串联基因。本发明专利技术使用的构建的串联细胞因子可以提高ｉＰＳ的诱导效率，进而减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于ｉＰＳ细胞在临床上的应用。

Optimized tandem cytokines and their use in the induction of pluripotent stem cells

The present invention provides an optimized tandem cytokine and a method for applying the cytokine to the induction of pluripotent stem cells. The cytokine Oct4F2AKlf4P2ASox2opt, the gene sequence of Oct4, F2A, Klf4, P2A and Sox2opt respectively, such as SEQ? ID? NO:6, SEQ? ID? NO:3 and SEQ? ID? NO:7, SEQ? ID? NO:4 and SEQ? ID? As shown in NO:8. F2A and P2A gene sequences, such as SEQ? ID? NO:3 and SEQ? ID? As shown in NO:4. PMXs vectors are used to carry optimized tandem genes. The invention uses the constructed series of cytokines could enhance the induction efficiency of iPS, thereby reducing the amount of sample cell, simplify the operation, improve the success rate, more conducive to the application of iPS cells in the clinic.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
的干细胞研究，具体涉及串连的密码子优化的人源细胞 因子，并将该细胞因子用于iPS细胞(induced Pluripotent Stem cells)的诱导的技术。
技术介绍
iPS(induced Pluripotent Stem cells)技术作为一个新兴的技术解决了胚胎干 细胞的来源的限制，并绕开了伦理的约束，为再生医学研究的提供了新的希望。早期的iPS 使用0ct3/4， Klf4， Sox2与Myc组合或0ct3/4， Klf4， Nanog与Lin28组合。为了简化试验 操作，提高iPS效率以及提高iPS的安全性，人们对iPS诱导技术方面进行了诸多改进，主 要可以分为以下几个方面 1)减少细胞因子个数。Myc和Klf有导致细胞癌变的特性，使用较少的细胞因子将 会有更高的安全性。实验证明可以使用0ct3/4和Klf4(Kim，J. B. et al，Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by r印rogramming withtwo factors. Nature 454 (2008) ， 646-50.该文献中文名为，使用两个重编程细胞因子从小鼠神经干细胞 中诱导多能干细胞。)，或者单独使用0ct3/4诱导出iPS(Kim， J. B. ， et al. 0ct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell 136 (2009) ， 411-9.该文献中文名为， 0ct4在成体神经干细胞中诱导的多能性。) 2)使用同一载体表达多个诱导因子。在做iPS诱导的过程中，同时转染或者感染多个诱导因子在实验操作上比较繁琐，特别使用质粒进行转染。多个研究小组使用串联 的基因进行iPS诱导(Carey， B. W. ， et al. R印rogramming ofmurine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl AcadSci USA 106(2009)， 157-62.该文献中文名为，用单个多顺反子载体重编程小鼠和人体细胞。Gonzalez, F. ， et al.Generation ofmouse—induced pluripotent stem cellsby transient expression of a single nonviral polycistronic vector. Proc Natl Acad SciUSA 106(2009)， 8918-22.该文献中文名为，通过瞬时表达一个单个非病毒多顺反子载体来产生小鼠的iPS 细胞。)。 3)使用安全的非整合诱导方式。如腺病毒，质粒，和蛋白形式的外源诱导因子。由 于腺病毒载体不整合到细胞的基因组并具有感染多种细胞的能力，人们用腺病毒进行iPS 诱导，但是此种方法得到的iPS诱导效率较低(Stadtfeld，M. ，et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science322 (2008) ， 945-9.该文献 中文名为，产生非病毒整合的iPS细胞。)。这可能是由于腺病毒携带了太多的病毒基因 所致。为了避免外源的细胞因子整合到细胞的基因组，人们也采取了多次转染质粒的方法 来获得iPS细胞(0kita， K. ， et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science322 (2008) ，949-53.该文献中文名为，使用非病 毒载体产生小鼠iPS细胞。)。为了彻底避免核酸引入，人们也开发了通过直接在细胞 培养基中加入细胞因子蛋白来诱导iPS(Kim， D. ， et al. Generation of human inducedpluripotent stem cells bydirect delivery of r印rogramming proteins. Cell Stem Cell 4 (2009) ，472-6.该文献中文名为，直接使用重编程蛋白产生人iPS细胞。Li， W.， et al.Generation of rat andhuman induced pluripotent stem cells by combining genetic r印rogramming andchemical inhibitors. Cell Stem Cell 4(2009) ， 16_9.该文 献中文名为，综合使用基因重编程蛋白和化学抑制物产生大鼠和人iPS细胞。)，但是遇到同样的问题iPS细胞的诱导效率较低。 4)结合辅助手段提高iPS效率。化学小分子药物丙戊酸(valproic acid(VPA)) 可以提高0ct3/4禾口Sox2的诱导效率(Huangfu，D. ，et al. Induction of pluripotentstem cells by defined factors is greatly improved by small—molecule compounds. NatBiotechnol 26 (2008) ， 795-7.该文献中文名为，小分子化合物可以大大提高固定 因子的多能干细胞诱导过程。)使用MicroRNA也可以提高iPS的诱导效率(Judsonet al. ， Embryonic stem cell—specific microRNAs promote induced pluripotency. NatBiotechnol 27 (2009) ， 459-61.该文献中文名为，胚胎干细胞特异的microRNA提高诱 导效率。)。 由此可见，iPS诱导技术呈现出多样性的特征。高效的iPS诱导系统是可以减少 样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。 在同一个质粒上表达多个基因的策略有多种1)使用多个启动子，每个启动子启 动独立的编码框。这个策略的缺陷是由于不同启动子的启动能力不同，并且重复串联的相 同启动子之间的相互干扰导致两个启动子的表达效率都降低。2)在一个启动子内部使用内 部核糖体进入位点(IRES)元件表达两个基因。IRES容易导致串联的表达框中的第二个基 因表达水平低于第一个基因。3)在融合蛋白的连接位点引入蛋白酶切位点，利用细胞内的 蛋白酶将串联蛋白切割成单个的功能蛋白，但是细胞内的蛋白酶酶切不充分，这个策略是 最不常用。能够在蛋白水平实现自我剪切的蛋白酶元件的发现为串联基因的发现提供了新 的可能性。 研究表明，一些正链病毒的基因组编码一个全长的融合蛋白，该融合蛋白没有 活性。其中有一段2A短肽(18-22氨基酸)可以在融合蛋白中自我切割，产生单个独立 的蛋白(参见如下文献Szymczak AL， Workman CJ， Wang Y本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子包含Ｏｃｔ４ｏｐｔ、Ｋｌｆ４ｏｐｔ和Ｓｏｘ２ｏｐｔ，所述Ｏｃｔ４ｏｐｔ、Ｋｌｆ４ｏｐｔ和Ｓｏｘ２ｏｐｔ的基因序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８所示。

【技术特征摘要】
一种优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子包含Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因序列分别如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示。2. 根据权利要求l所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述0ct4opt、Klf4opt和 Sox2opt的基因连接顺序由5，端到3，端依次为0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt。3. 根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因 子还含有串联片段，所述串联片段为2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述 F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。4. 根据权利要求3所述的优化的串连细胞因子，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，陈凌，李锋，米盖尔埃斯特班，冯立强，谢海军，陈捷凯，秦大江，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]