结合域-免疫球蛋白融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及结合域－免疫球蛋白融合蛋白。其特征在于对相关结构，如抗原、反受体等的结合域、具有０或１个半胱氨酸残基的铰链区多肽、以及免疫球蛋白ＣＨ２和ＣＨ３结构域。尽管主要作为单体多肽存在，该融合蛋白能够ＡＤＣＣ和／或ＣＤＣ。该融合蛋白可以高表达水平重组产生。也提供了相关的组合物和方法，包括免疫治疗应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及具有免疫学活性的重组结合蛋白，具体涉及分子工 程化的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，包括单链Fv-免疫球蛋白融合蛋 白，本专利技术也涉及用于治疗恶性状况和B细胞疾病，包括特征在于自 身抗体产生的疾病的组合物和方法.
技术介绍
免疫球蛋白分子由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，它们通 过链间二疏键连接成大分子复合物.链内二疏鍵连接相同多肽链的不 同区域，这导致形成环，该环与邻近的氛基酸构成免疫球蛋白结构域. 每条轻链和每条重链具有单个可变区，该区表现出抗体之间氨基酸组 成的很大变异.轻链可变区VL与重链可变区Vh締合，形成免疫球蛋 白的抗原结合位点Fv.轻链具有单个恒定区结构域，重链有几个恒定 区结构域.IgG IgA和IgD具有三个恒定区结构域，称为CH1， CH2 和CH3， IgM和lgE具有四个恒定区结构域.免疫球蛋白重链可以分为三个功能区Fd、铰链区和Fc, Fd区包 含VH和CH1结构域，与轻链一起形成Fab. Fc片段一般认为负责免 疫球蛋白的效应物功能，例如，补体固定和结合与Fc受体.在IgGj IgA 和IgD中发现的铰链区作为柔性的间隔基，允许Fab部分在空间中自 由移动.与恒定区相反，铰链区结构域结构多样，各类和亚类的免疫 球蛋白之间序列和长度都有变化.例如，人类IgG的三种亚类，IgGl， IgG2和IgG4具有12 — 15个氛基酸的铰链区，而IgG3含有约62个氨 基酸，包括21个脯氨酸残基和11个半胱氨酸残基.根据结晶学研究， 铰链区可进一步根据功能细分为三个区上铰链区、核心和下铰链区 (Shin et al.， Immunological Reviews 130: 87 (1992)).上铰链区包含CH1的羧基端的氨基酸至限制运动的铰链区的笫一个残基， 一般是第 一个半胱氨酸残基，它在两条重链之间形成链间二破鍵.上铰链区的 长度与抗体的片段柔性相关.核心铰链区含有重链间二疏键，下铰链区连接CH2结构域的氨基末端并且包含CH2中的残基.(Id.)人IgG 的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，当形成而二硫鍵时，该序列 形成一个环状八肽，人们认为该八肽作为一个轴，由此赋予柔性.铰 链区也可以含有碳水化合物附着位点.例如，IgAl在铰链区的一个17 氨基酸的片段中含有S个碳水化合物位点，它们赋予了铰链区对肠蛋 白酵的例外抗性，这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利特征.铰链区的结构和柔性所允许的构象改变可以影响抗体的Fc部分的 效应物功能.与Fc区相关的效应物功能的三个大类包括(1)激活经 典的补体级联，(2)与效应分子相互作用和(3)免疫球蛋白的区室化. 不同的人IgG亚类在其激活和扩增补体刑量的步驟的相对效力方面有 所不同. 一般说来，IgGl和IgG3最有效固定补体，IgG2效力较低， 而IgG4不激活补体，补体激活是由Clq与抗原抗体复合物的结合起 始的，Clq是级联中的笫一个成分Cl的一个亚基.尽管Clq的结合 位点位于抗体的CH2结构域，铰链区影响抗体激活級联的能力.例如， 缺乏铰链区的重组免疫球蛋白不能激活补体,(W.)如果没有铰链区所赋 予的柔性，与抗原结合的抗体的Fab部分可能不能采用允许Clq与 CH2结合所需的构象.(见id.)研究表明，铰链区长度和片段柔性与补 体激活相关；然而，该相关不是绝对的.具有与IgG4相同的刚性的改 变的铰链区的人IgG3分子仍然有效激活该级联.铰链区的缺乏也影响人IgG免疫球蛋白结合免疫效应细胞上的Fc 受体的能力.免疫球蛋白与Fc受体的结合促进抗体依赖性细胞毒性 (ADCC),它被推定为消除肿瘤细胞的重要方式，人IgG Fc受体家族 被分为三组，即，能够结合具有高亲和性的IgG的FcyRI(CD64)、都 是低亲和性受体的FcyRII (CD32)和FcyRHI (CD16).三种受体的每一 种和免疫球蛋白之间的分子相互作用还没有精确确定，但实验表明， CH2结构域的铰链近端区中的残基对抗体和Fc受体之间的相互作用 的特异性是重要的.此外，IgGl骨拔瘤蛋白和缺乏铰链区的重組IgG3 嵌合抗体不能结合FcyRI,很可能是因为对CH2的可接近性减少(Shin et al.， Intern. Rev. Immunol. 10: 177,178-79 (1993)).7单克隆抗体技术和基因工程方法导致了用于诊断和治疗人疾病的 免疫球蛋白分子的迅速开发.已经应用了蛋白工程改进抗体与其关联 抗原的亲和性，以减少与免疫原性相关的问趙，并且改变抗体的效应 物功能.免疫球蛋白的域结构容易顺应工程化，这是由于抗原结合域 和赋予效应物功能的结构域可以在免疫球蛋白种类和亚类之间交换.此外，构建了较小的免疫球蛋白分子，以克服与完整的免疫球蛋白的治疗相关的问题.单链Fv(scFv)包含通过短的接头肽与轻链可变区 连接的重链可变区(Huston et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA， 85: 5879-83,1988),由于scFv分子较小，它们表现出4艮快从血浆和组织清 除，并且比完整免疫球蛋白更有效穿透到組织中.抗肺瘤scFv表现出 与相应嵌合抗体更迅速的肿瘤穿透和在肿瘤团块中更平均的分布 (Yokota et al.， Cancer Res. 52,3402-08 (1992)). ScFv与另 一种分子，如 毒素的融合利用了特异性的抗原结合活性和scFv的小尺寸而将毒素递 送到把組织(Chaudary et al Nature 339 : 394 (1989); Batra et al Mol. Cell. Biol. 11: 2200 (1991)),尽管scFv分子的优点实现了血清疗法，该治疗方法仍存在一些缺 陷.尽管scFv的迅速清除可以减少在正常细胞中的毒性作用，这种迅 速清除可能阻碍向靶组织递送最小的有效刑量.由于不利影响产量的 表达和分离的困难，制备足重的用于给予患者的scFv是具有挑战性的， 在表达过程中，scFv分子缺乏稳定性并且由于不同分子的可变区的配 对而经常聚集，此外，哺乳动物表达系统中的scFv分子的产量水平低， 因此限制了有效制备用于治疗的scFv分子的可能性(Davis et al， J Biol. Chem. 265: 10410-18 (1990); Traunecker et al EMBO J 10: 3655-59 (1991)).已经探索了改进产量水平的策略，包括向可变区添加糖基化 位点(Jost， C. R. US Patent # 5,888,773， Jost et al， J, Biol. Chem. 269: 26267-73 (1994)).毒素与scFV的偶联或融合提供了非常强效的分子，但由于毒素分 子的毒性，给药是有限的.毒性作用包括升高肝醉和血管渗漏综合征. 此外，免疫毒素是高度免疫原性的，并且抗毒素的宿主抗体限制了其 用于重复治疗的可能性.使用scFv进行治疗的其它缺点是缺乏效应物功能.与免疫球蛋白 恒定区缔合的，没有细胞毒性功能、ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)的scFv可能对于治疗疾病是无效的.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合域－免疫球蛋白融合蛋白，包含：　（ａ）与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽，其中所述铰链区多肽选自（ｉ）含有一个或两个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的铰链区多肽，前提是当铰 链肽含有两个半胱氨酸时，负责与野生型免疫球蛋白铰链区多肽中的轻链恒定区形成二硫键的铰链的第一半胱氨酸不被缺失或取代，（ｉｉ）野生型人ＩｇＡ铰链区多肽，和（ｉｉｉ）不含半胱氨酸残基并且来源于野生型人ＩｇＡ区多肽的突变的人ＩｇＡ铰链区多肽；　 　（ｂ）与铰链区多肽融合的免疫球蛋白重链ＣＨ２恒定区多肽；和　（ｃ）与ＣＨ２恒定区多肽融合的免疫球蛋白重链ＣＨ３恒定区多肽，其中：　（１）结合域－免疫球蛋白融合蛋白具有至少一种选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体固定的免疫活 性，并且　（２）结合域多肽能够特异性结合于ＣＤ２０。

【技术特征摘要】
US 2001-1-17 09/7652081.一种结合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽，其中所述铰链区多肽选自(i)含有一个或两个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的铰链区多肽，前提是当铰链肽含有两个半胱氨酸时，负责与野生型免疫球蛋白铰链区多肽中的轻链恒定区形成二硫键的铰链的第一半胱氨酸不被缺失或取代，(ii)野生型人IgA铰链区多肽，和(iii)不含半胱氨酸残基并且来源于野生型人IgA区多肽的突变的人IgA铰链区多肽；(b)与铰链区多肽融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽；和(c)与CH2恒定区多肽融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽，其中(1)结合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一种选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体固定的免疫活性，并且(2)结合域多肽能够特异性结合于CD20。2. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，并且相对于野生型人免疫球蛋白G 铰链区多肽，表现出二聚化的能力降低.3. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽 包括至少一种免疫球蛋白可变区多肽，其选自免疫球蛋白轻链可变区 多肽和免疫球蛋白重链可变区多肽.4. 权利要求3的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 可变区多肽来源于人免疫球蛋白.5. 权利要求1的结合域免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽包 含(a)至少一种免疫球蛋白轻链可变区多肽；(b)至少一种免疫球蛋白 重链可变区多肽；和(c)至少一种与(a)的多肽和与(b)的多肽融合的接头 肽.6. 权利要求5的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 轻链可变区和重链可变区多肽来源于人免疫球蛋白.7. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中至少一种免 疫球蛋白重链CH2恒定区多肽和免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽来 源于人免疫球蛋白重链.8. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 重链恒定区CH2和CH3多肽属于选自人IgG和人IgA的同种型.9. 权利要求1的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽 是来源于单克隆抗体G28-12H7的羊链Fv.10. 权利要求S的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，其中接头多肽包 括至少一种具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-SerSEQ ID NO : 21的 多肽.11. 权利要求S的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接头多肽包 括具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO : 21]的多肽的至 少三次重复.12. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽包括人IgA铰链区多肽.13. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨 酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽.14. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于人IgGl铰链区多肽.15. 权利要求1的结合域—免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽含有一个半胱氨酸残基并且来源于人IgG2铰链区多肽、人 IgG3铰链区多肽，或人IgG4铰链区多肽.16. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基.17. 权利要求l的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白 铰链区多肽是突变的铰链区多肽，其含有两个半胱氨酸残基，并且来 源于野生型IgG...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA勒贝特尔，M海登勒贝特尔，
申请(专利权)人：特鲁比昂药品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]