稳定的免疫球蛋白恒定结构域制造技术

本发明专利技术涉及包含至少一个恒定抗体结构域的多结构域模块式抗体、基于所述抗体的文库以及生产方法，所述抗体被突变形成人工二硫键，这通过诱变所述恒定结构域来向氨基酸序列中引入至少一个Cys残基，从而获得构架区内的结构域内或结构域间二硫键而进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的免疫球蛋白恒定结构域本专利技术涉及一种包含至少一个恒定抗体结构域的多结构域免疫球蛋白，其是稳定的。多克隆抗体已经广泛用作治疗结合剂。本文使用完整的IgGl免疫球蛋白作为实例阐释基本的抗体结构。两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)组合形成Y型抗体分子。每个重链具有四个结构域。氨基端可变结构域(VH)位于Y的顶端。在IgG、IgD和IgA的情形中，这些之后接着三个恒定结构域CH1，CH2，和羧基端CH3，其位于Y茎干的基底部。在IgM和IgE 的情形中，有四个不同的恒定结构域。一个短片段，“转换区(switch)”，连接重链可变区和恒定区。铰合部将CH2和CH3(Fc片段)与抗体其余部分(Fab片段)连接。通过蛋白水解分解完整抗体分子中的铰合部可以产生一个Fc和两个相同的Fab片段。轻链由被转换区分开的两个结构域(即，可变(VL)和恒定(CL)结构域)构成。铰链区中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键偶联到重链上。取决于免疫球蛋白的种类，Asn-连接的糖类结构部分附着在恒定结构域中的不同位置。对于人 IgGl，铰链区中位于Cys2^和Cys2^对之间的两个二硫键将两条重链联合起来。轻链通过两个另外的二硫键而偶联到重链上，所述二硫键位于CHl结构域中kr221之后的Cys和 CL结构域中Cys2Hs之间。糖类结构部分附着在每个CH2的Asn297上，在Y茎干产生明显的凸出。此处的数字按照Kabat编号方案给出。这些特征具有意义深远的功能结果。重链和轻链(VH)和(VL)的可变区位于Y的 “顶端”，它们位于此处与抗原反应。分子的这一顶端是氨基酸序列的N端所在的一侧。Y的茎干以足以介导效应子功能(诸如补体激活和与Fc受体的相互作用、或ADCC和ADCP)的方式凸出。其CH2和CH3结构域凸出，以促进与效应蛋白的相互作用。氨基酸序列的C端位于顶端的对侧(其可以称为Y的“底部”)。在抗体中发现两种类型的轻链，称为IambdaU )和kappa ( κ )。给定的免疫球蛋白或者具有κ链或者具有λ链，从不具有每种类型各一条链。在具有λ或Κ轻链的抗体之间没有发现功能差异。抗体分子中的每个结构域具有相似的结构，即两个β折叠彼此相对紧密包装在压缩的反向平行的β桶(beta barrel)中。这种保守的结构称为免疫球蛋白折叠。恒定结构域的免疫球蛋白折叠包含相对4-链折叠包装的3-链折叠。该折叠通过每个折叠的 β链之间的氢键、通过内部相反折叠的残基之间的疏水键、和通过折叠之间的二硫键稳定。 3-链折叠包含C，F，和G链，并且4-链折叠包含Α，B，Ε，和D链。字母A至G表示β链沿着免疫球蛋白折叠氨基酸序列的顺次位置。可变结构域的折叠具有9个β链，排列在4链和5链的两个折叠中。5-链折叠与恒定结构域的3-链折叠在结构上同源，但是包含额外的C'和C"链。其余的链(Α，B, C， D，Ε，F，G)具有与它们在恒定结构域免疫球蛋白折叠中的对应体相同的拓扑结构和相似的结构。二硫键连接位于相反折叠中的B链和F链，如同在恒定结构域中一样。免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链二者的可变结构域包含三个超变环，或互补性决定区(⑶Rs)。V结构域的三个⑶Rs (⑶R1，⑶R2，⑶R3)簇集在β桶的一个末端。⑶Rs 是连接免疫球蛋白折叠的β链B-C，C' -C"，和F-G的环。在一种免疫球蛋白分子和另一种之间，CDRs中的残基是不同的，这赋予每种抗体的抗原特异性。在抗体分子顶端的VL和VH结构域紧密包装，以致6个⑶Rs (每个结构域上3个) 协作构建成用于抗原特异性结合的表面(或腔)。因此，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变结构域的链B-C，C' -C"，和F-G与重链可变结构域的链B-C，C' -C"，和F-G的环组成。不是天然免疫球蛋白中的CDR-环、与抗原结合口袋分开的环(抗原结合口袋由 CDR环和在CDR环区内有助于抗原结合口袋的任选相邻的环确定)，不具有抗原结合或表位结合特异性，但是有助于完整的免疫球蛋白分子的正确折叠，因此其被称为用于本专利技术目的的结构环。现有技术文献表明，目前已将免疫球蛋白支架用于操作现有的抗原结合位点由此引入新的结合特性的目的。在大部分情形中，CDR区已被改造用于不同的抗原结合，换言之， 在免疫球蛋白折叠的情形中，仅天然抗原结合位点被修饰，从而改变其结合亲和性或特异性。存在大量的文献，它们记述不同形式的这样操作的免疫球蛋白，其通常以单链Fv片段 (scFv)或Fab片段形式表达，展示在噬菌体颗粒表面上或可溶性表达在各种原核或真核表达系统中。在本领域中已经提议各种免疫球蛋白文库，用来获得特异性的免疫球蛋白结合齐U。然而，由于在改造抗原结合口袋时对构架的可能的破坏，因此用于制备这样的文库的支架是有限的。现有技术还涉及稳定单CH2抗体结构域。Gong等(J. Biol. Chem.(生物化学杂志) (2009)284(21) :14203-14210)记述了分离的、未糖基化的人CH2单结构域，其对热诱导的解折叠相对不稳定。将突变CH2结构域改造，其在天然二硫键区内，即在N端A链和C端G 链之间，具有另外的二硫键。由此用单体CH2获得Tm为至多73°C的热稳定性。改造的单结构域CH2结构域还称为纳米抗体，其可以用作支架(Dimitrov(2009)mAbsl :1,26-28) 0记述CH3结构域的二聚体化在抗体组装中起关键作用。Mcauley等(Protein Science (蛋白质科学)(2008) 17 :95-106)教导CH3结构域内在Cys367和Cys425(按照 Kabat编号方案)之间的二硫键是包埋的且高度保守。该二硫键不是二聚体化必需的，原因在于重组的人CH3结构域，甚至在还原状态，以二聚体存在。W006072620A1记述了改造免疫球蛋白的方法，其包括在结构环区中的修饰以获得新的抗原结合位点。该方法广泛适用于免疫球蛋白，并且可以用来产生靶向各种抗原的免疫球蛋白文库。已经表明CH3文库有效用于选择针对抗原的特异性结合剂。W02009/000006A1记述了产生与靶标和支架配体结合的抗体结构域的寡聚体的方法。W02006/036834A1记述了结合到Fc结构域中的生物活性的肽。存在对于提供用于制备各种文库的稳定的免疫球蛋白的需求。因此，本专利技术的目的是提供改进的免疫球蛋白作为抗体改造的支架。该目的通过所要求的主题解决。专利技术_既述按照本专利技术，提供了包含至少一个恒定抗体结构域的多结构域模块式抗体4(modular antibody)，所述抗体被突变形成人工二硫键，其通过诱变所述恒定结构域来向氨基酸序列中引入至少一个Cys残基，从而获得构架区内的结构域内或结构域间二硫键而进行。优选地，本专利技术所述的模块式抗体包含由所述人工二硫键连接的至少两个恒定结构域。本专利技术所述的优选的模块式抗体具有抗原结合区，优选地在突变位点旁边的抗原结合区。因此，本专利技术所述的优选的模块式抗体具有在抗体的抗原结合位点旁引入的所述至少一个Cys残基。本专利技术所述的模块式抗体优选地是全长抗体或抗体的一部分，诸如Fab，Fe,或至少一个恒定结构域与恒定结构域或可变结构域中的至少一个的其它组合。本专利技术所述的模块式抗体优选地包含通过引入至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗洛里安·吕尔克，戈尔达娜·沃伊尼亚克克诺普，戈特弗里德·希姆莱，
申请(专利权)人：F斯塔生物技术研究和发展有限公司，
类型：发明
国别省市：