羰基清除剂用于制备在异常细胞中诱导或加速细胞死亡的药物的用途制造技术

羰基清除剂，其已知具有与活性羰基种反应的能力，已经暗示其能够作为加速或诱导异常细胞死亡、而对正常细胞没有平行作用的药剂。同样，当期望加速或诱导细胞死亡时，比如在正常凋亡途径已被破坏并发生过度增殖性细胞增长的细胞中，它们是有用的治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过应用羰基清除剂比如二羰基清除剂诱导细胞死亡的方法。
技术介绍
逐渐增加的皮肤病发病率，包括非黑素瘤疾病，以及黑素瘤皮肤癌，已经有很多的文献记载，同时对恶化前和恶性阶段的皮肤癌一直都缺乏有效的治疗方法。Diegpen，et al.，Br.J.Dermatology1461-6(2002)已经记载非黑素瘤皮肤癌，或者称作“NMSC”，是影响高加索人种最常见的癌症类型。接近80％的NMSC是基底细胞癌，20％是鳞状细胞癌。已知的光化性角化病的状态是一种癌前状态，其可以发展成鳞状细胞癌。发展成侵袭性、鳞状细胞癌的速率的估计范围高达每年20％。见May，J.，Am.Acad.Dermatol.428-10(2000)。尽管在美国黑素瘤只占所有皮肤癌疾病的约5％，但是它占皮肤癌死亡的约80％。早期诊断经外科切除导致很高的治愈率；然而，恶性黑素瘤有非常高的扩散和转移的趋势。黑素瘤细胞对化疗、所有形式的治疗性诱导细胞凋亡以及任何形式的治疗有很高的抗性。最近已经观察到细胞羰基胁迫涉及增殖性信号传递和人肿瘤细胞转移，细胞羰基胁迫由内源性、活性羰基种，或称作“RCS”介导，特别是二羰基化合物，包括乙二醛、甲基乙二醛和丙二醛，它们在糖酵解和脂质过氧化期间形成。见，例如，Taguchi，et al.，Nature405(6784)354-60(2000)。RCS-来源的蛋白质表位，称作“高级糖基化终产物”，或“AGE”，其通过RCS和组织蛋白间的反应形成，其在黑素瘤中大量发现，并且AGE是非常有效的RAGE配体，其是参与黑素瘤增殖和转移的膜受体。见，例如，Abe et al.，J.Invest.Dermatol.122(2)，461-467(2004)。越来越多的证据支持这种观点，即根本上源于肿瘤细胞糖酵解增加和线粒体脂质过氧化的RCS是小分子的抗细胞凋亡调节因子，其通过共价修饰来抑制线粒体通透性转变孔的开放。见，例如，Speer，et al.，J.Biol.Chem.278(37)，34757-63。Wondrak et al.，Biochem.Pharmacol.71051-13(2002)，已经鉴定一系列非常有效的、无毒性羰基清除剂，它们可用于治疗性干预细胞的羰基胁迫。这篇参考文献经引用并入本文，以及公告日为4/6/2004的美国专利No.6,716,635和公告日为7/9/2002的美国专利No.6,417,235。‘635专利特别给出了RCS和RAGE化合物、作用机制，它们如何形成等的详细说明。现在已经发现这些羰基清除剂对黑素瘤和其它癌细胞具有显著的诱导凋亡作用，但是对正常细胞没有这种作用。这是本专利技术的特征，正如在随后的实例中所指出的。附图说明图1描述使用D-青霉胺对恶性黑素瘤细胞系、鼠(B16)和人(G-361、A-375、LOX)细胞系诱导凋亡的比较。在本图中，“C”表示对照，“P”表示用D-青霉胺处理。图2总结对恶化前、永生化人角质形成细胞暴露于D-青霉胺之后的试验结果。图3显示在恶性、人鳞状细胞癌细胞系A431，暴露于D-青霉胺、以及D-青霉胺甲酯之后，细胞凋亡的诱导。图4显示对上皮细胞癌细胞系使用D-青霉胺，N-乙酰-D-青霉胺和氨基胍的结果总结。图5比较在人黑素瘤细胞系A375和正常的成纤维细胞系CF3中诱导的细胞凋亡。所用的化合物是D-青霉胺的亲脂衍生物、3-巯基亮氨酸。图6显示对羰基清除剂活性存在结构要求，其中测试了D-青霉胺、氨基胍、N-乙酰-D-青霉胺和青霉胺二硫化物。图7显示根据本专利技术的化合物在正常和恶性细胞的混合物中选择性消除恶性黑素瘤细胞的功效。图8显示凋亡机制涉及线粒体跨膜电位的去极化。具体实施例方式实施例1本实施例描述的试验显示3-巯基-D-缬氨酸(“D-青霉胺”)诱导恶性细胞系的凋亡。使用鼠黑素瘤细胞系B16，以及三种人黑素瘤细胞系，即，G-361、A-375和LOX。细胞样品持续24小时暴露于10mM D-青霉胺。使用标准测试测量细胞凋亡，即，使用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术。作为对照，使用正常的人皮肤成纤维细胞，即，“CF3”细胞。图1的结果显示对照(没有化合物)和处理(有化合物)，分别在顶部和底部。从这些附图中可以明确在恶性细胞中诱导了细胞凋亡，然而在正常CF3细胞中没有变化。在没有显示于附图的试验中，3-巯基异亮氨酸产生了相似结果。实施例2在这些试验中，加入浓度为12.5mM的D-青霉胺到恶化前、永生化人角质形成细胞，或“HaCaT”细胞中，持续暴露24小时。在图2中，对照(没有化合物)列在左边，测试化合物D-青霉胺的效果显示在右边。细胞凋亡也被指出。实施例3这组试验使用D-青霉胺和它的更亲脂的衍生物，D-青霉胺甲酯。为了制备这种衍生物，搅拌保存在-10℃的75ml MeOH中的18ml SOCl2，加入不同量的D-青霉胺(15g，100.5mmol)。混合物达到室温时继续搅拌。混合物回流60小时，然后蒸发溶剂，留下粗产物(15.2g，93.3mmol)，将其溶解于甲醇中，然后加入乙醚进行结晶。收集结晶产物，在真空中干燥，得到7.6g纯产物。它的结构通过1H-NMR和质谱分析确定。C6H14O2NS的计算m/z是164.1+，观察值是164.1。在各种情况下，对人A431细胞使用10mM测试化合物持续24小时，并如前述测量细胞凋亡。在图3中，“D-P”表示D-青霉胺，“D-P-OCH3”是其甲酯。应用该酯观察到更强的细胞凋亡作用。实施例4测定化合物对其他癌症，特别是上皮癌，的功效。使用人HeLa宫颈腺癌细胞，并用10mM D-青霉胺和25mM氨基胍进行测试。这些细胞用N-乙酰-D-青霉胺测试，其不具有羰基清除剂的功能。图4表示对照(“C”)、D-青霉胺(“D-P”)、N-乙酰-D-青霉胺(“NAP”)和氨基胍(“AG”)的这些试验的结果。已知作为羰基清除剂的D-青霉胺和氨基胍是凋亡诱导剂，而NAP不是。实施例5与之前测试的那些比较，3-甲基-3-乙基-L-半胱氨酸(3-巯基异亮氨酸，或称作“MEC”)是一种更加亲脂的羰基清除剂。因为可以期望在局部给药系统中增加亲脂性，测试这个化合物是有意义的。MEC被合成至95％纯度，根据Leach，B.E.et al.“Synthesis of D，L-penicillaminefrom N-acetyl-D，L-penicillamine”in Clarke，H.T.ed.，The Chemistry of Penicillin，(Princeton University Press，1949)，Pg.466，并且通过1H-NMR确认其结构。用10mM MEC暴露24小时测试恶性人黑素瘤细胞A375和正常成纤维细胞(CF3)。在恶性细胞中观察到明显的诱导凋亡，但是在正常细胞中却没有观察到，正如在图5中所见的。实施例6这些试验被设计用来确定是否有结构/功能的关系。换句话说，希望确定是否作为羰基清除剂而不是作为抗氧化剂的活性对抗癌活性是重要的。化合物D-青霉胺(D-P)、氨基胍(AG)、N-乙酰-D-青霉胺(NAP)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和青霉胺二硫化物(PSS)被测试。本文档来自技高网...

【技术保护点】
在异常细胞中诱导或加速细胞死亡的方法，包括向所述异常细胞施用足以诱导或加速所述异常细胞死亡的量的羰基清除剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治T翁德拉克，伊莱恩L雅各布森，迈伦K雅各布森，
申请(专利权)人：代表亚利桑那大学的亚利桑那校董会，
类型：发明
国别省市：US[美国]