本发明专利技术公开了对限定在同三聚体或异三聚体卷曲螺旋结构中的α－螺旋嵌合肽进行共价稳定的方法。通过在本说明书中公开的方法制备的卷曲螺旋结构模拟在包膜病毒膜融合蛋白的融合性构象内的内部三聚体卷曲螺旋基元特别是ＨＩＶ ｇｐ４１胞外域的内部卷曲螺旋结构域的全部或一部分。公开的ＨＩＶ－衍生的嵌合肽包含非ＨＩＶ的卷曲螺旋的可溶三聚体形式，其以螺旋态与ＨＩＶ ｇｐ４１的Ｎ－螺旋的全部或一部分融合且通过在所述肽之间形成二硫键或化学选择性键被稳定在同三聚体或异三聚体卷曲螺旋结构内。通过在此公开的方法制备的共价稳定的ＨＩＶ－衍生的同三聚体或异三聚体卷曲螺旋结构代表了对ＨＩＶ ｇｐ４１融合中间体的近似模拟物且是ＨＩＶ感染的有力抑制剂。这些ＨＩＶ衍生的嵌合肽通过抑制病毒－宿主细胞膜融合过程提供了对ＨＩＶ感染的治疗方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对限制在同三聚体或异三聚体卷曲螺旋(coiled-coil)结构中的α-螺旋嵌合肽进行共价稳定的方法，其中所述卷曲螺旋结构模拟限制在包膜病毒膜融合蛋白的融合构象中的内部的三聚体卷曲螺旋基元(motif)的全部或一部分。在一具体实施方式中，本专利技术涉及对同三聚体卷曲螺旋结构进行共价稳定的方法，该结构模拟HIV gp41胞外域的内部卷曲螺旋结构域的全部或一部分，其中嵌合肽通过在加在所述肽的NH2-或COOH-端的半胱氨酸残基之间形成二硫键被稳定在所述的卷曲螺旋结构中，该嵌合肽包含了以螺旋态与HIV gp41的N-螺旋的全部或一部分融合的卷曲螺旋的非HIV可溶三聚体形式。通过化学选择性连接反应产生的共价键对模拟HIV gp41胞外域的内部卷曲螺旋结构域的三聚体卷曲螺旋结构进行稳定的方法也被公开。通过在此公开的方法制备的共价稳定的，HIV衍生卷曲螺旋结构代表了HIVgp41融合中间体的近似模拟物且是HIV感染的有力抑制剂。
技术介绍
人体免疫缺陷病毒(HIV)是获得性人体免疫缺陷综合症(AIDS)和相关疾病的致病原。HIV基因编码至少9个蛋白且蛋白被分成三类主要的结构蛋白(Gag、Pol和Env)；调节蛋白(Tat和Rev)；以及辅助蛋白(Vpu、Vpr、Vif和Nef)。evn基因编码病毒包膜糖蛋白，该糖蛋白被翻译成160千道尔顿(kDa)的前体(gp160)并随后被细胞蛋白酶切割生成胞外120kDa包膜糖蛋白(gp120)和跨膜41kDa包膜糖蛋白(gp41)。Gp120和gp41通过不稳定的非共价结合保持连接。HIV向宿主细胞的进入是通过gp120与存在于辅助T淋巴细胞、巨噬细胞和其它靶细胞表面的CD4受体的相互作用从包膜复合体中释放gp120而启动的。该相互作用在gp120中引起了微弱的构象变化，暴露出了V3环的结构元件，该元件随后与第二个宿主细胞受体，CCR5或CXCR4趋化因子受体相互作用。一旦pg120被完全暴露，gp41发生巨大的构象变化，该变化最终导致病毒和细胞膜的融合以及病毒内容物向宿主细胞胞质中的插入。Gp41介导融合是一复杂的过程，该过程涉及三个位于糖蛋白胞外域的关键组分NH2-端融合肽、NH2-端七肽重复区域(“N-螺旋”)和COOH-端七肽重复区域(“C-螺旋”)。两个七肽重复区域(NH2HR1；COOHHR2)赋予了糖蛋白周期性的疏水性且预示着α-螺旋结构的存在，这些结构相互作用形成gp41的融合(即融合活性的)构象，即所谓的“发夹三聚体(trimer-of-hairpin)”，这是在很多包膜病毒融合机制中涉及的常见结构基元。发夹三聚体结构是六个α-螺旋形成的束三个α-螺旋(由三个gp41胞外域的C-螺旋区域形成)以反向平行的方式排布在居中的三股的卷曲螺旋(由三个gp41胞外域的N-螺旋区域形成)上。融合过程通过gp41“准发夹”构象的形成而进行，该构象将NH2-端融合肽置于靶细胞膜附近/靶细胞膜内，暴露出N-螺旋的卷曲螺旋。当三个C-螺旋折叠回来与居中的N-螺旋的卷曲螺旋结合时发夹三聚体形成，将病毒和宿主细胞膜拉至近距离接触成为膜融合的前奏。可用于HIV感染个体的有效的治疗方法包括靶向反转录酶或病毒蛋白酶的抗逆转录病毒试剂的联合治疗。该种治疗在临时控制病毒载量方面已有效；但是，随着时间在大多数患者体内药物抗性的形成、坚持遵守复杂疗法的必要性以及潜在的毒性作用强调了开发新的对抗HIV感染的治疗方法的重要性。为了满足这些需要，正在对新的一类靶向病毒进入的抗逆转录病毒试剂进行研究，这些试剂被称作“融合抑制剂”。设计融合抑制剂以抑制HIV与靶细胞膜的结合，在病毒进入免疫细胞之前阻断病毒。FDA最近批准了第一例此新类型的抗逆转录病毒试剂，Fuzeon(恩夫韦地(enfuvirtide)；也被称作T-20)和其它抗HIV药物的联合使用。T-20是合成肽中的一种，这些合成肽是分别衍生自gp41的C-或N-螺旋区域的“C-肽”或“N-肽”，这些肽已经显示能够抑制HIV-I病毒的感染。C-肽，包括T-20，以显性抑制方式(dominant-negative manner)与gp41的N-螺旋结合，阻止融合的发夹三聚体的形成并抑制HIV-I的感染性。N-肽也通过靶向gp41的暴露的C-螺旋区域或形成异三聚体卷曲螺旋并干扰gp41卷曲螺旋的形成来抑制HIV-I的进入。防止病毒/宿主细胞膜融合的抗HIV试剂还包括与准发夹或发夹三聚体复合物结合的中和抗体。由此，由居中的N-螺旋的卷曲螺旋形成的在gp41胞外域的七肽重复区域1(HR1)内的疏水口袋被认为是激发具有广泛交叉反应活性的HIV的中和抗体的诱人靶点。HIV-I的N-肽是较C-肽而言弱得多的病毒入侵抑制剂，可能是由于N-肽在缺少C-螺旋区域时发生聚集的事实。为了促进非聚集的、三聚体的N-肽卷曲螺旋的形成，Eckert等(1999，Cell 99103-115)构建了嵌合N-肽，该肽包含N-螺旋结构域的一部分，该部分与可溶的作为骨架的三聚体卷曲螺旋将融合。该肽，被称作IQN17(也在PCT国际申请PCT/US99/17351；国际公开号WO 00/06599中公开)，形成了可溶的、稳定的三聚体卷曲螺旋。Eckert和Kim(2001，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9811187-11192)测试了IQN17和其它相似构建的与其它卷曲螺旋骨架融合的嵌合N-肽，例如IZN17(在PCT国际申请PCT/US01/29637；国际公开号WO 02/24735中也被公开)的抑制活性，将所述肽认定为HIV-I入侵的有力抑制剂。这些结果暗示N-肽的抑制活性可能与它们的稳定性相关。为了进一步稳定N-肽以实现产生对HIV融合更接近的模拟物的目的，本专利技术公开了可溶的嵌合N-肽，通过在肽序列的末端添加半胱氨酸残基这些肽被共价稳定在三聚体构象中。通过在中性pH下的氧化，在相邻的N-肽分子上的工程半胱氨酸残基之间形成二硫桥。通过在位于所述个体肽的α-螺旋结构域外部的工程半胱氨酸残基之间形成二硫键从而将HIV gp41的嵌合N-肽稳定在同三聚体或异三聚体卷曲螺旋构象的方法也可被用于已知在病毒-靶细胞膜融合过程中形成内部的卷曲螺旋基元的其它包膜病毒膜融合蛋白。Louis，J.M.等(2001，J.Biol.Chem.27629485-29489)公开了通过分子间二硫桥得以稳定的嵌合gp41分子，该分子包含嫁接至gp41的最小六螺旋束的NH2-端上的N-螺旋结构域。二硫键产生于半胱氨酸残基之间，这些半胱氨酸残基是通过将gp41胞外域的位于N-螺旋区域内的残基576-578突变成半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸(Cys-Cys-Gly)而被引入六螺旋束的。Louis，J.M.等(2003，J.Biol.Chem.27820278-20285)和PCT国际申请PCT/US02/40684(国际公开号WO 03/052122)公开了两种包含了HIV-I gp41胞外域的内部N-螺旋的卷曲螺旋的可溶的、共价连接的三聚体多肽。由于将gp41胞外域的残基576-578处的N-螺旋突变成Cys-Cys-Gly，HIV序列通过工程化的亚单元间的二硫键被稳定。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对模拟包膜病毒膜融合蛋白的内部三聚体卷曲螺旋基元的全部或一部分的三聚体卷曲螺旋结构进行共价稳定的方法，包括： （ａ）制造包含α－螺旋结构域的可溶嵌合肽，该结构域组成以螺旋态与所述包膜病毒膜融合蛋白的Ｎ－末端七肽重复结构域的全部或一部分或其修饰形式融合的卷曲螺旋的可溶三聚体形式；以及 （ｂ）通过在所述肽之间形成共价键将三个来自（ａ）的嵌合肽稳定在三聚体卷曲螺旋结构中，其中所述共价键选自二硫键和由化学选择性反应生成的共价键。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：E比安基，A佩西，R格勒齐乌纳斯，D布拉姆希尔，
申请(专利权)人：默克公司，P安杰莱蒂分子生物学研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。