本发明专利技术涉及新型高效降血糖苦瓜ＭＣ－ＪＪ０１０１多肽类似物及其微波促进固相合成方法。通过对天然苦瓜多肽的２，４，５，８或９位点进行改造得到具有更长药理作用时间的ＭＣ－ＪＪ０１０１多肽类似物；其化学合成是通过微波促进固相合成方法而得以高效快速实现，粗品经制备级高效液相纯化，最后冻干得到ＭＣ－ＪＪ０１０１多肽类似物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及MC-JJ0101多肽类似物及其微波促进固相合成方法。
技术介绍
糖尿病是当今危害人类健康的重要疾病，目前全世界约有5% -7%的人受糖尿病 困扰，被认为是继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后，导致人类伤残、死亡的第三大杀手。糖尿病分为I型和II型，I型糖尿病是一种自身免疫疾病，患者的存活需要注射 胰岛素。II型糖尿病占众多糖尿病患者总数的95%左右。II型糖尿病的原因是胰岛细胞 代谢发生障碍，胰岛素分泌不足，或者产生胰岛素抵抗，是以胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌 相对不足，或者以胰岛素分泌相对不足为主伴胰岛素抵抗导致的代谢性疾病。胰岛素分泌 不足，或者产生胰岛素抵抗都可造成血液中葡萄糖过量，当血糖含量超过肾阈时，葡萄糖就 转移到尿中排出，从而产生葡萄糖尿。苦瓜(Momordica charantia)是一种人类有长期安全食用历史的蔬菜。近二十年 来，人们在苦瓜的果实中发现了许多具有降血糖活性的成分，其中的多肽成分逐渐得到人 们的认识并得到一些运用，但是由于苦瓜多肽的提取分离过于复杂，成本较高又难于得到 纯的多肽，现在我们运用现代多肽合成技术能够解决这一问题。多肽可以通过基因工程的方法或者化学合成的方法得到。基因工程的方法在获取 长肽(氨基酸残基长度大于50)或蛋白质上比化学方法有优势，但是多肽的化学合成方法 尤其是在固相合成策略出现后，在制备氨基酸残基长度小于40的多肽或小肽上有基因工 程方法难以比拟的灵活性、多样性和高效性等。1963年Merrifield创立并开发了固相合成 多肽的方法。固相多肽合成一般有两种策略即Boc/Bzl正交保护固相合成策略和Fmoc/ tBu正交保护固相合成策略，Merrifield创立的固相合成法即为Boc/Bzl正交保护固相合 成策略。但是，Boc/Bzl正交保护固相合成策略中存在一些缺点，如副反应多、条件苛刻以及 在延长肽链的过程中多肽链会从固相上丢失等。而随后出现的Fmoc/tBu正交保护固相合 成策略则反应条件温和的多。当近年来微波技术运用于多肽的固相合成中后，使多肽的合 成技术产生了一个飞跃。微波促进化学反应是由于其使极性分子在微波场中快速旋转，使 得一些反应速率较常规加热方法快10到1000倍，而且产率大大提高。1986年Gedye等人 首次报道了将微波应用于有机合成中，微波可以促进许多化学反应，如Diels-Alder反应， 皂化反应等，可以显著地加快反应速率并提高收率。在1992年，Hui-ming Yu等首先报道 了将微波应用于多肽固相合成领域中，他们完成了酰基载体蛋白片断十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。如何高效的合成长肽，在世界上仍然是一个挑战，因为多肽随着肽链的增加，其合 成难度成倍增加。用传统的固相方法合成长肽，其收率往往很低杂质较多纯化困难，从而从 实用的角度上说失去了合成的意义。其次合成周期长，在中间不出现困难肽序的情况下10 肽一般需要近一个星期时间才能完成合成周期，如果出现困难肽序，往往就无法合成得到 目标多肽。而使用微波促进固相合成多肽，可以克服困难肽序，合成传统固相方法无法得到的多肽，而且合成时间大大缩短，且显著提高多肽粗品纯度及收率，使得产品的纯化大大方 便，只要经过一次制备型HPLC就能得到纯度较高的产品；此外还可以非常方便的用D型氨 基酸及非天然氨基酸等对多肽进行定点修饰，去寻找活性更高、生物半衰期更长的多肽，这 更是基因工程技术无法做到的。因此，我们在苦瓜降血糖(MC-JJ0101)多肽类似物的合成 中采用此种方法快速高效的合成得到MC-JJOlOl系列类似物。
技术实现思路
本专利技术有两个目的第一个目的是从具降血糖活性的药食同源植物苦瓜中得到多肽进行修饰得到降血糖活性更高的MC-JJ0101多肽类似物。本专利技术的第二个目的是提供了 MC-JJ0101衍生物的固相制备方法，本专利技术采用微 波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ0101类似物。其特征在于采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合 成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到 载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨 基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树 月旨，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯 化，冻干得多肽纯品。载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征是通过在微波照射条件 下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基_苯并 三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。载有第一个Fmoc保护 氨基酸的树脂所使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。活化剂 是二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、N, N"-羰基二咪唑(⑶I)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(H0SU)、1_羟 基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-1，2，3-苯并三嗪_4 (3H)-酮(HOOBT)。有机碱 为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)；微波促进条件是微波频率 2450MHz，反应温度20 100°C，反应时间为5 15min。Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0. lmol. L—1的1_羟基-苯并三氮唑(HOBT)的 六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亚砜(DMSO)、或N-甲基 吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂。微波促进条件是微波频率2450MHz，反应温度20 100°C， 反应时间为1 IOmin。本专利技术的优点在于1.提出的一种MC-JJOlOl类似物可以在保留降糖活性的基础上，提高MC-JJOlOl 的稳定性，延长作用时间。2.微波促进固相合成MC-JJOlOl类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合 成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微 波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到 1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。3.微波促进固相合成MC-JJ0101类似物合成得到的粗品的纯度大于85%，较常规 固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作，只需要经过一次制备液相纯化，冻干即 可得到目标纯品。4.微波促进固相方法合成MC-JJ0101类似物，其成本低，由于偶合效率较高，所需 要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。5.微波促进固相合成MC-JJ0101类似物方法易于实现自动化、大规模化，这使本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有降血糖活性的含有式Ⅰ（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１）结构的苦瓜ＭＣ－ＪＪ０１０１多肽类似物，得到的苦瓜ＭＣ－ＪＪ０１０１多肽类似物；其特征在于其结构具有以下形式：Ｐｒｏ－Ｘａａ↓［１］－Ｇｌｙ－Ｘａａ↓［２］－Ｘａａ↓［３］－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｘａａ↓［４］－Ｘａａ↓［５］－Ｓｅｒ（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１）Ｘａａ↓［１］：Ａｌａ，Ｄ－Ａｌａ，Ｇｌｙ或ＳｅｒＸａａ↓［２］：Ａｌａ，Ｄ－Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ或ＳｅｒＸａａ↓［３］：Ａｌａ，Ｄ－Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｙｒ或ＳｅｒＸａａ↓［４］：Ｌｙｓ或ＳｅｒＸａａ↓［５］：Ａｌａ，Ｄ－Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｃｙｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ或Ｓｅｒ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄文龙，金晶，钱海，张惠斌，王敬杰，陈巍，曹金明，戴冬艳，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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