本发明专利技术公开了多肽合成领域的一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺，该工艺共有十个步骤：将配对半胱氨酸残基编号；选择三对配对的半胱氨酸残基；将多肽序列固定在固相载体上；浸泡树脂、添加氧化剂、形成二硫键；过滤溶剂、清洗树脂；去除半胱氨酸残基中的特异性；过滤溶剂、检测、清洗树脂；浸泡树脂、添加氧化剂、形成二硫键；过滤溶剂、清洗树脂；用试剂检测、对比本发明专利技术与常规工艺的优劣。本发明专利技术具有节省时间、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽合成领域，更具体地说，本专利技术涉及一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺。
技术介绍
多肽传统的氧化方法是在树脂上把序列合成完后，用酸把产物裂解下来，然后用空气氧化或者DMSO氧化，或者双氧水或者典等氧化的方法。传统氧化方法存在以下缺点:空气氧化和DMSO氧化缺点是溶剂体积太大，氧化时间过长，一般是Img产物对I毫升的溶齐U，最后都要有几百毫升的体积，氧化好后还要去除溶剂然后再纯化。而且这两种多肽氧化方法耗时很长，一般氧化用时2天左右，除溶剂也要两天左右。所以在整个生产过程中，氧化这一步骤就要占用很大的比例。双氧水或者碘氧化的方法虽然用时比较短，但是都有局限性，序列中如果含有甲硫氨酸或者天门冬氨酸就不能用双氧水这种强氧化剂氧化，而且他对溶剂的酸碱度等也有要求。碘氧化步骤比较繁琐而且产率不高，氧化后要马上处理否则样品会有变的可能性。二硫键环化多肽也有固相环化的方法，既一般是用特殊的巯基保护基(比如ACM，MMT等)在多肽序列合成完后用特殊物质去除巯基的特殊保护，然后在树脂上氧化，这样的好处是氧化完成后直接切割拿到的产物就是所需要的最终产物，节约了大量的人力物力。上述的方法大部分只能合成单个二硫键的环化，对于目前比较复杂的多对二硫键的多肽的合成则没有什么优势，本专利技术涉及多对二硫键的定点环化固相合成多肽的新工艺。其中运用了低成 本环保的单保护的多肽二硫键环化固相技术和传统的特殊巯基保护基的二硫键环化技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺。本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的:一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺，所述的新工艺亦称树脂上氧化工艺，所述的新工艺按如下具体步骤如下:第一步，由于需要多对二硫键，所以适宜的多肽序列含有四个以上半胱氨酸残基，将要配对的半胱氨酸残基进行编号；第二步，将配对的半胱氨酸残基选择一对用单保护的半胱氨酸，一对用H-Cys (Acm) -0H, 一对用 H-Cys (MMT) -OH ；第三步，应用多肽固相合成技术将多肽序列固定在固相载体上，其中对应的半胱氨酸残基采用单保护或者用H-Cys (Acm) -OH或者用H-Cys (MMT) -OH ；第四步，序列合成完成后，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，然后添加氧化剂，将序列中两个单保护的半胱氨酸残基的-SH氧化，形成二硫键；第五步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂； 第六步，将树脂加入含有I %的脱除剂的有机溶剂的容器中，进行其中两个半胱氨酸残基保护基的特异性去除；第七步，用砂芯滤柱过滤溶剂用ELLMAN试剂检测，用纯DCM和DMF清洗树脂；第八步，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，添加氧化剂，将已去除-HS保护基的两个半胱氨酸残基的-SH氧化，形成二硫键；第九步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂；第十步，用ELLMAN试剂检测，查看反应是否完全，对比本专利技术和常规工艺的两对二硫键氧化肽合成的优劣。与现有技术先比，本专利技术具有以下有益效果:节省时间、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本。具体实施例方式下面将通过实施例对本专利技术的实质性内容作进一步的详细描述:经过实验验证本氧 化方法在多肽固相有机合成中的实用性、有效性和先进性。实施例:合成一条序列为DKCYGLACASCEFEPCLL的肽，序列中两端两个半胱氨酸之间形成一对二硫键，中间两个半胱氨酸之间形成一对二硫键。原理:通过载体固定序列的羧基端，按照顺序合成，待合成完序列后在把序列从载体上裂解下来之前，让序列中两个半胱氨酸上的巯基通过一定的技术手段形成二硫键，并计算收率。准备工作:配置茚三酮检测试剂20ml，20%的六氢吡啶脱帽液，DMF, DCM,甲醇，配置好的三氟乙酸裂解液。其它原料:Fmoc-Leu_wang树脂，HBTU, DIEA, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (Otbu) -OH, Fmoc-Ser (Tbu) -0H,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(Otbu)-OH, Fmoc-Cys(MMT) -OH, Fmoc-Tyr(Tbu)-OH, Fmoc-Giy-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH.实验步骤:I。精确称取担载量为0.5的Fmoc-Leu-wang树脂1G，投入定制的反应柱中，然后再在反应柱中加入IOML的DCM，浸泡十分钟，待树脂完全膨胀开，抽掉DCM。2.向反应柱中加入IOml的配置好的20%的六氢吡啶，反应十分钟，然后抽掉反应液，重复两次，目的是完全去除Fmoc,反应完成后用DCM和DMF反复交替清洗树脂把残留的六氢吡啶洗掉。洗完后用茚三酮检测树脂上是否有游离的氨基。3.精确称取 Fmoc-Leu-OH0.7g，HBTU0.4g，用 4ml 的 DMF 溶解好后，加入 0.5ml 的DIEA，混合均匀后投入2步骤的反应柱中，用氮气鼓泡搅拌，反应30，min后抽掉反应液，清洗树脂。取几粒树脂装入小试管中，然后在小试管中加入少量事先配置好的茚三酮检测试齐U，加热3min无色则说明反应已经完全，然后加入IOml的配置好的20%的六氢吡啶，去除Fmoc,方法同步骤2。4.精确称取 Fmoc-Cys-OH0.5g，HBTU0.6g，用 4ml 的 DMF 溶解好后，加入 0.5ml 的DIEA，混合均匀后投入反应柱中，然后加入少许抗氧化剂，用氮气鼓泡搅拌，反应30min后抽掉反应液，清洗树脂，检测，无色则，去除Fmoc保护基，检测有蓝紫色。5.精确称取 Fmoc-Pro-OH0.51g, HBTU0.6g,用 4mlDMF 溶解，加入 0.5ml 的 DIEA，混合均匀投入反应柱，加入少许抗氧化剂，反应30min后抽掉反应液，清洗树脂，检测，无色则去除Fmoc保护基，检测有蓝紫色。6.同理，按照多肽序列中氨基酸残基的次序由C端往N端依次链接，在第二个第三个半胱氨酸残基的时候用Fmoc-Cys(MMT),最右端的半胱氨酸残基用Fmoc-Cys-OH7.待序列合成完成后，用甲醇冲洗树脂，抽干，配置含有氧化剂的有机溶剂，将树脂投入溶剂中进行第一个二硫键的环化，期间用Ellman试剂进行监控，待检测无色时将溶剂滤掉。然后用DCM清洗树脂。8.配置含有I %冰醋酸的DCM溶剂，将树脂投入溶剂中反应60min。将剩余的两个保护氨基酸的侧链-HS的保护基去除，然后滤掉溶剂，DM清洗，加入7中的氧化剂进行第二对二硫键的环化，期间用Ellman试剂进行监控，待检测无色时将溶剂滤掉。然后用DCM清洗树脂。9.抽干，倒入50ML离心管中，倒入配置好的切割液比例约为IOml每克树脂，需要注意的是切割液中不要加硫醇。10.将离心管放在恒温振荡器上，震荡2h。11.用砂芯漏斗过滤掉树脂，得到滤液，然后往滤液中加入乙醚，比例是每ml滤液加20ml乙醚，目的是将产物析出，12.离心。去掉上清液即得到粗品。13.经分离提纯，冻干等步得到最终合格的产品。结论:经MS，HP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺，所述的新工艺亦称树脂上氧化工艺，其特征在于，所述的新工艺按如下具体步骤如下：第一步，由于需要多对二硫键，所以适宜的多肽序列含有四个以上半胱氨酸残基，将要配对的半胱氨酸残基进行编号；第二步，将配对的半胱氨酸残基选择一对用单保护的半胱氨酸，一对用H?Cys(Acm)?OH，一对用H?Cys(MMT)?OH；第三步，应用多肽固相合成技术将多肽序列固定在固相载体上，其中对应的半胱氨酸残基采用单保护或者用H?Cys(Acm)?OH或者用H?Cys(MMT)?OH；第四步，序列合成完成后，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，然后添加氧化剂，将序列中两个单保护的半胱氨酸残基的?SH氧化，形成二硫键；第五步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂；第六步，将树脂加入含有1％的脱除剂的有机溶剂的容器中，对其中两个半胱氨酸残基保护基的特异性去除；第七步，用砂芯滤柱过滤溶剂，用ELLMAN试剂检测，用纯DCM和DMF清洗树脂；第八步，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，添加氧化剂，将已去除?HS保护基的两个半胱氨酸残基的?SH氧化，形成二硫键；第九步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂；第十步，用ELLMAN试剂检测，查看反应是否完全，对比本专利技术和常规工艺的两对二硫键氧化肽合成的优劣。...
【技术特征摘要】
1.一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺，所述的新工艺亦称树脂上氧化工艺，其特征在于，所述的新工艺按如下具体步骤如下: 第一步，由于需要多对二硫键，所以适宜的多肽序列含有四个以上半胱氨酸残基，将要配对的半胱氨酸残基进行编号； 第二步，将配对的半胱氨酸残基选择一对用单保护的半胱氨酸，一对用H-Cys (Acm) -OH, 一对用 H-Cys (MMT) -OH ； 第三步，应用多肽固相合成技术将多肽序列固定在固相载体上，其中对应的半胱氨酸残基采用单保护或者用H-Cys (Acm) -OH或者用H-Cys (MMT) -OH ； 第四步，序列合成完成后，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，然后添...
【专利技术属性】
技术研发人员：王锡平，
申请(专利权)人：苏州强耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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