本发明专利技术公开了一种分支多肽的制备方法，包括如下步骤：a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂；b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步骤依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接：①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键；③再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的；c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，得到目标肽的粗品。本发明专利技术利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体地说是一种属于中长肽的分支多肽的制备方法。
技术介绍
RNA病毒的高变异能力对生产针对这类病毒感染的疫苗是极大的挑战，这些病毒主要包括流感病毒、HIV和HCV等。由不同型别流感病毒引起的流感大流行时刻威胁着全球，而现有流感疫苗的保护效果受到疫苗毒株与实际流行株的匹配程度的制约。所以为了研制对甲型流感病毒各种亚型或突变株都有效的通用疫苗，人们将目光投向了流感病毒较为保守的核蛋白(NP)和基质蛋白 2 (M2) (GS Jimenez, R Planchon, Q Wei, Hum Vaccin, 3(5) :157-64, 2007 ；M Schotsaert, M De Filette, W Fiers, Expert Rev Vaccines, 8 (4)499-508,2009)。抗病毒疫苗的保护效果除了与针对的病毒蛋白有关，还与疫苗的类型有关。合成肽疫苗，尤其是筛选病毒的抗原表位并采用人工合成方法制成的表位肽疫苗具有很多优点可避免不利于免疫应答的表位而选择有利于免疫应答的表位，在保持抗原特异性的基础上诱导免疫应答；可用化学合成的方法制备，研发时间短、工艺简单并且制备过程安全，获得病毒抗原序列信息后可很快完成制备过程，因此适宜应对新发、突发传染病。但抗原表位多是短肽，分子量小，抗原性和免疫原性都很弱，采用中长肽才能发挥疫苗的作用。对于中长肽的合成，液相合成法的最大障碍在于合成步骤极多(超出100多步)；其次工艺过程过于复杂，变量太多，难以控制和放大；而且原材料来源也受限制。为此，需要研究一种适于属于中长肽的分支多肽的制备方法，以提供一种免疫原性高的分支多肽。该方法有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单(过滤和洗涤)。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了。该方法适于中长肽的制备，有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单(过滤和洗涤)。尤其适用于制备一种免疫原性高的分支多肽。为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案，包括如下步骤a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂；b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步过程依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键；③再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的；c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，从而得到目标肽的粗品。进一步,所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下(AAN) 8- (Lys) 4_ (Lys) 2_Lys—Thr—Lys—Pro—Arg ；或(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ；其中AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，上述分支多肽的羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg 为免疫活性肽 Tuftsin。进一步，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的的序列如 下Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser—Ser—Asp。进一步，所述步骤c为加入各组分为分析纯，在常温下按体积比混合的如下切割液 TFA TA EDT TIS H2O 苯酚=7 I I O. I O. 35 O. 5，室温下振荡3-5h ;抽滤将氨基酸树脂与滤液分离；再用体积比为20% TFA/DCM洗涤氨基酸树脂3次，洗涤液并入抽滤出的切割液；冰浴下，向滤液中加入0°C的乙醚沉淀出粗肽，抽滤除去溶剂，并用无水乙醚洗涤沉淀3-4次，抽滤去除乙醚，干燥后得目标肽粗品。进一步，在步骤c之后采用反相高效液相色谱法对目标肽粗品进行纯化，冰冻干燥得目标肽纯品。进一步,其中氨基酸树脂的取代常数为O. 35mmol/g0进一步，在步骤b中采用茚三酮定性显色法来监测偶合反应终点，其试剂包括A) 5%茚三酮的正丁醇溶液；B) 20%苯酚的正丁醇溶液；C)吡啶溶液。进一步，在步骤b中，以DIC/H0BT的组合作为羧基活化剂，以进行缩合反应。进一步，在步骤c中，用30%六氢吡啶为去保护剂使保护基分离。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于本专利技术的分支多肽的制备方法适于中长肽的制备，有利于工艺过程控制和放大；原材料来源稳定，后处理方法简单，仅需过滤和洗涤。尤其适用于制备一种免疫原性高的分支多肽。附图说明图I为本专利技术的分支多肽的制备方法的较佳实施例的制备路线示意图；图2为本专利技术的分支多肽的制备方法的较佳实施例的工艺流程图；图3为本专利技术的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的精制图谱；图4为本专利技术的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的质量检测报告(RP-HPLC)；图5为本专利技术的分支多肽的制备方法的较佳实施例的目标产品的质量检测报告(Maldi-TOF MS)；具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细描述，但不作为对本专利技术的限定。下面以名称为H9901的由99个氨基酸组成的四分支多肽作为目标产品为例对本专利技术的方法进行详细阐述，其氨基酸组成序列如下单字母「(slltevetpirnewgcrcndssd)2-k」2-ktkpr三字母「(H-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-GIy-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种分支多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 a.选择目标肽链的羧基端的第一个氨基酸，在其氨基被保护的条件下将其羧基以共价键的形式与固体载体相连得到氨基酸树脂； b.以步骤a中连接到固体载体上的第一个氨基酸为合成的起点，通过不断重复以下三步过程依次完成目标肽的每一个氨基酸的连接①氨基端脱保护，洗涤过滤；②在氨基和侧链均保护的条件下与相邻氨基酸的羧基发生缩合酰化反应，形成肽键再次过滤洗涤；其中分支部分则是采用含有两个氨基的赖氨酸来实现的； c.通过切割反应和后处理，将目标肽链与氨基酸树脂以及所有的侧链保护基分离，从而得到目标肽的粗品。2.根据权利要求I所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下(AAN) 8- (Lys) 4~ (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ;或(AAN) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ； 其中AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，上述分支多肽的羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg 为免疫活性肽 Tuftsin。3.根据权利要求2所述的分支多肽的制备方法，其特征在于，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氣基端到竣基端的的序列如下Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩苏，张智清，张文涛，
申请(专利权)人：北京中天康泰生物科技有限公司，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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