本发明专利技术涉及提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方及应用，其特征在于二甲苯溶剂配方由以下原料按体积比组成：二甲基甲酰胺ＤＭＦ／二氯甲烷ＤＣＭ／二甲苯ＤＭＢ＝１／１．５～２．５／０．１５～１．０。其有效地降低了合成多肽的成本；其降低了氨基酸疏水侧链及保护基团的空间阻碍效应，缩短反应时间，使多肽合成速度加快，多肽产率高，杂质少。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方及应用，属于多肽固相 合成领域。
技术介绍
多肽固相合成常用的是活化酯法接肽反应，其反应机理为亲核加成-消除反应， 脱保护的氨基亲核进攻氨基酸活化酯的羰基碳，形成带电荷的四面体过渡态，随着羟基苯 骈三氮唑的消除，形成酰胺键。由于过渡态带电荷，根据溶剂化效应，极性大的溶剂有利过 渡态的稳定。溶剂的极性越大反应速度就越快，弱极性溶剂不利于此反应发生，所以在肽合 成中通常采用强极性的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为的溶剂，但是随着肽链的增长，链中氨 基酸疏水性的侧链及侧链保护基(如丝氨酸的羟基保护基叔丁基、组氨酸咪唑基的保护基 三苯甲基)在强极性溶剂中必然会发生链内聚集，使肽链卷曲产生强大的空间阻碍效应， 导致肽链上已脱保护的氨基很难与已活化的氨基酸羧基接触，两个反应基团无法接触就无 法发生反应。在这种情况下，有效地降低空间阻碍效应就成了多肽固相合成成功的关键。 解决此问题通常采用混合溶剂的方法，就是往强极性溶剂反应体系中加入一些弱极性的溶 剂，以打开链中聚集的疏水性基团，降低接肽反应中的空间阻碍效应。目前，最常用的混合 溶剂DMF/DCM(二氯甲烷)=3/0. 5，即便是这样，一般情况下，前几位氨基酸每个耗时约 1. 5小时即可完成连接反应，但是随后的氨基酸连接反应速度成倍下降导致连接效果不佳、 产率低下，从而使合成多肽的成本成倍提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方，旨在克服 现有合成方法时间长及产率低的不足，该配方通过降低氨基酸疏水性侧链及保护基团链内 聚集造成的空间阻碍效应，缩短反应时间，使多肽合成速度加快、多肽产率增高、杂质少易 纯化，从而提高合成多肽的效率，降低了合成多肽的成本。本专利技术的另一目的在于提供一种二甲苯溶剂在提高多肽固相合成效率中的应用。本专利技术的技术方案是这样实现的提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方，其 特征在于多肽连接反应的溶剂体系由以下溶剂按体积比组成二甲基甲酰胺DMF 1，二氯 甲烷DCM 1. 5 2. 5，二甲苯DMB0. 15 1. 0 ；根据实际情况适当调节二氯甲烷DCM和二甲 苯DMB的比例使树脂不沉不浮地悬在溶剂中为最佳。本专利技术就是在多肽固相合成中，以DMB(二甲苯)为主要原料的溶剂来降低氨基酸 疏水性的侧链及侧链保护基链内聚集产生的空间阻碍效应，提高多肽合成效率。以合成抗菌肽 V13K (Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS-amide)为例，按体积比当 溶剂二甲基甲酰胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25时合成V13K耗时，除第9位的 组氨酸为8小时外，7-16位中其它的氨基酸连接反应约为3-4小时，而对应常用的二甲基甲 酰胺DMF 3，二氯甲烷DCM 0. 5混合溶剂合成V13K的7_16位氨基酸连接反应耗时均大于10小时，第9位的组氨酸耗时甚至大于20小时如表1所示。由此可见，新配方能有效地降 低阻碍反应的空间效应，大大地缩短了连接反应时间。第9位的组氨酸连接时间长是因为 组氨酸咪唑基的保护基三苯甲基体积大，空间阻碍效应大造成的，若在连接此组氨酸时改 用二甲基甲酰胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 5的比例时5小时即可完成反应，但 是用此比例的混合溶剂替代二甲基甲酰胺DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25连接其 它7-16位氨基酸耗时反而有所增加。也就是说在连接其它7-16位氨基酸时二甲基甲酰胺 DMF 1，二氯甲烷DCM 2，二甲苯DMB 0. 25的混合溶剂体系就已经能有效地降低了阻碍反应 的空间效应，使肽链上已脱保护的氨基与已活化的氨基酸羧基能够接触并发生反应，而弱 极性的二甲苯的进一步增加反而降低了能够有效接触的两个反应基团的反应性。本专利技术的积极效果是以合成V13K为例，在合成时间上比常用的DMF-DCM体系缩 短4倍；在粗产品上对比表现出产量高、杂质少，在纯品产率上(25-35mg/0. lmmol)比常用 DMF-DCM体系(7-9mg/0. lmmol)高约4倍；综合效率提高4X4 = 16倍，有效地降低了合成 多肽的成本；其有效降低了氨基酸疏水侧链及保护基团链内聚集造成的的空间阻碍效应， 缩短反应时间，使多肽合成速度加快、多肽产率高、杂质少。表1溶剂专利技术配方与常用配方合成V13K耗时情况的比较 附图说明 图1氨基Fmoc保护基的脱保护机理图2氨基酸羧基的活化机理图3活化酯法接肽反应的机理图4带侧链保护基的组氨酸、丝氨酸、赖氨酸图5专利技术配方(红)与常用配方(黑)合成V13K粗产品分析色谱图比较 具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的描述实施例1:溶剂配方二甲基甲酰胺(DMF)/ 二氯甲烷(DCM)/ 二甲苯(DMB) = 1/2/0. 25如图1-4所示，以在抗菌肽V13K的合成中使用该配方作为接肽反应的溶剂，经检 测，V13K的第7 16位氨基酸连接时间缩短至3-4小时，其中第9位组氨酸连接时间为8 小时，得到纯品产率25-35mg/0. Immol树脂。在相同条件下，使用传统常用溶剂，V13K的第 7 16位氨基酸连接时间超过10小时，其中第9位组氨酸连接时间甚至超过20小时，得到 纯品产率7-9mg/0. Immol树脂。实施例和前述过程中所采用的原料列表如下 具体步骤如下脱帽试剂为六氢吡啶DMF = 1 4，体积比；所说的接肽溶剂为DMF DCM DMB = 1 2 0. 25，体积比；在接肽试剂中，HBTU的摩尔数为原料树脂的4. 5倍，HOBt的摩尔数为原料树脂的3. 5倍。所说的茚三酮检测试剂为溶液A，水合茚三酮乙醇=5 100，质量体积比。溶 液B，苯酚乙醇=80 20，体积比。溶液C，0. OOlM的氰化钾水溶液吡啶=1 49，体 积比。(1)取 125mg Rink amide MBHA 树脂(0. 8mmol/g 树脂，0. lmmol)，用 3ml DCM浸泡 8h，使树脂充分溶胀，抽干。(2)加入5ml脱帽试剂，25°C反应30分钟，抽干，分别用DMF、异丙醇和DCM各洗涤 三次，抽干。(3)力口 入 0.4mmol Fmoc-氨基酸、0.45mmol HBTU、0. 35mmol HOBtUlOul DIEA (0. 742g/ml)用6. 5ml溶剂配方溶解，加入反应容器，25°C反应3-4小时。(4)抽干，分别用DMF、异丙醇和DCM各洗涤三次，抽干。(5)取少量的树脂加入到1. 5ml EP管中分别加入50 μ 1 A，B，C溶液，混勻100°C 加热5min，树脂为透亮黄色表示反应完全。(6)重复步骤(2)-(5)直到最后一个氨基酸连接到树脂上。(7)加入5ml脱帽试剂，25°C反应30分钟，抽干，分别用DMF、异丙醇和DCM各洗涤 三次，抽干。分别用DMF、异丙醇和DCM各洗涤三次，抽干。(8)依次用DCM，DMF, DCM,甲醇，DCM各洗涤两次，减压抽滤12小时。(9)加入切肽试剂(TFA/H20/TIS = 3. 6ml/0. 2ml/0. 2ml)，25°C搅拌 2 小时。减 压抽取溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方，其特征在于由以下原料按体积比组成：二甲基甲酰胺ＤＭＦ／二氯甲烷ＤＣＭ／二甲苯ＤＭＢ＝１／１．５～２．５／０．１５～１．０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈育新，毛世忠，黄宜兵，王笑非，潘玲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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