一种空肠弯曲菌荧光定量ＰＣＲ检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种空肠弯曲菌荧光定量ＰＣＲ基因检测方法及其试剂盒，用该方法能够快速准确地检测空肠弯曲菌，减少了假阳性。所述试剂盒，包括如下试剂：ＰＣＲ?ＭＩＸ反应液：５×ＦＱ?ＰＣＲ?ｂｕｆｆｅｒ、浓度为１０ｕＭ的引物混合物、浓度为１０ｕＭ的ＴａｑＭａｎ探针混合物、浓度为１０ｍＭ的ｄＮＴＰｓ和ｄｄＨ２Ｏ，其中所述引物混合物中含有：１６Ｓ?ｒＲＮＡ上游引物Ｆ、１６Ｓ?ｒＲＮＡ下游引物Ｒ、上游引物ｈｉｐＯ－Ｆ和下游引物ｈｉｐＯ－Ｒ，ＴａｑＭａｎ探针混合物中含有：１６Ｓ?ｒＲＮＡ－Ｐ和ｈｉｐＯ－Ｐ；（２）Ｔａｑ酶；（３）阳性标准品和阴性标准品。本发明专利技术引入了高效、特异性强的扩增引物和荧光探针，使得空肠弯曲菌检测的灵敏度和特异性大大提高，避免了漏检和误检。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的核酸检测试剂盒及其检测方 法，属于生物

技术介绍
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是在世界范围内广泛流行的人兽共患病的 重要致病菌，不但引起多种畜禽疾病，还能造成人类食物中毒，研究证明，人感染空肠弯曲 菌，大多数情况下都直接或间接地与动物性食品有关。在各国各类细菌性的食物中毒中，空 肠弯曲菌所导致的食物中毒常居前列，因此世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性疾病之一。空肠弯曲菌可存在于多类食品中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、鱼、虾等食品。空肠弯 曲菌在食品加工过程受伤而处于亚致死状态，并且在水中会进入一种“非可培养状态”，因 此进一步增加了发生污染的可能性以及检测的难度。目前国内外报道的检测空肠弯曲菌的 试剂盒筛选法，虽减少操作步骤、缩小了检测目标，但仍存在假阳性以及成本过高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种空肠弯曲菌荧光定量PCR基因检测方法及其试剂盒，用 该方法能够快速准确地检测空肠弯曲菌，减少了假阳性。本专利技术提供一种空肠弯曲菌荧光定量PCR基因检测试剂盒，包括如下试剂(I)PCR MIX反应液5XFQ PCR buffer、浓度为IOuM的引物混合物、浓度为IOuM 的TaqMan探针混合物、浓度为IOmM的dNTPs和ddH20，其中所述引物混合物中含有16S rRNA上游引物F、16S rRNA下游引物R、上游引物hipO_F和下游引物hipO-R，TaqMan探针 混合物中含有16S rRNA-P和hipO_P ；所述16S rRNA 上游引物 F 序列为5，-TGCTTAACACAAGTTGAGTAGG-3，；所述16S rRNA 下游引物 R 序列为5，-TTCCTTAGGTACCGTCAGAA-3，；所述上游引物hipO-F 序列为5，-TAGGACTTCGTGCAGATATGG-3，；所述下游引物hipO-R 序列为5，-AATCCATCTTCTATCATTGCCT-3，；所述16S rRNA-P 序列为5，-AACCCTGACGCAGCAACGCCGC-3，(SEQID N0. 3)，其 5， 端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述hipO-Ρ 序列为5，-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3，(SEQ IDN0.6)，5，端标 记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。(2) Taq 酶；(3)阳性标准品和阴性标准品，所述阳性标准品是浓度为1 X 107copies/mL的目的 片段重组质粒。所述PCR MIX反应液中所述5 X FQ PCR buffer、引物混合物、TaqMan探针混合物、 dNTPS 和 ddH20 的体积混合比为 10 1 0. 5 1 30. 5。3本专利技术还提供用权利要求1或2所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法，包括如下步 骤(1)样品及阳性对照的DNA提取(2)反应体系中含有PCR MIX反应液24yL、Taq酶2yL，样品DNA提取液4yL， 阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH20 ；反应程序为93°C反应2min，93°C反应30s，58°C 反应45s，45个循环。(3)结果分析Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性，即样品中有空肠 弯曲菌。本专利技术用于空肠弯曲菌检测的荧光定量PCR方法及其试剂盒，实现了对空肠弯曲 菌进行快速准确检测的目的。由于该方法引入了高效、特异性强的扩增引物和荧光探针，使 得空肠弯曲菌检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，并避免了漏检和误检。具体实施例方式实施例1本专利技术试剂盒的组成1.基础试剂盒的构成(1)PCR MIX反应液，其成分为5XFQ PCR buffer、浓 度为ΙΟμΜ的引物混合物(各引物浓度均为ΙΟμΜ)、浓度为ΙΟμΜ的TaqMan探针混 合物(各探针浓度均为10 μ Μ)、浓度为IOmM的dNTPS和ddH20，各成分的体积混合比 为10 1 0.5 1 30.5 ；所述引物混合物含有上游引物16S rRNA_F、下游引物 16S rRNA-R、上游引物hipO-F和下游引物hipO-R，TaqMan探针混合物有16S rRNA_P和 hip0-P ;(2)Taq酶；(3)阳性标准品(1 X 107copies/ml)和阴性标准品。(I)PCR MIX反应液中组分I :5XFQ PCR buffer 组成为250mM 的 Tris-HCl (ρΗ8· 0)、35mM 的 MgCl2、250mM 的 KCl以及10% (体积浓度)的DMS0。II 引物、探针的设计及制备如下挑选已经过国际协同试验验证通过的耐热弯曲菌(空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海 鸥弯曲菌)的16S rRNA引物16S rRNA 上游引物 F :5，-TGCTTAACACAAGTTGAGTAGG-3，(SEQ IDN0. 1)；16S rRNA 下游引物 R :5，-TTCCTTAGGTACCGTCAGAA-3，) (SEQ IDN0. 2)；本专利技术人设计了TaqMan 探针 16S rRNA-P :5，-AACCCTGACGCAGCAACGCCGC-3，(SEQ ID N0. 3)，其5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。本专利技术人还设计了针对空肠弯曲菌的hipO基因序列的特异引物和Taqman荧光探 针上游引物hip0-F :5，-TAGGACTTCGTGCAGATATGG-3，(SEQ ID N0. 4)；下游引物hip0-R :5，-AATCCATCTTCTATCATTGCCT-3，(SEQ ID N0. 5)；hip0-P (Taqman 荧光探针)5，-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3，(SEQ ID N0. 6)， 5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。III dNTPS和ddH20按照常规方法制备。(2) Taq酶购自大连宝生物有限公司(3)阳性标准品以空肠弯曲菌的16S rRNA基因(NCBI登录号为AB454519. 1)为模板，以16S rRNA-F与16S rRNA-R为引物进行扩增反应；以hipO基因(NCBI登录号为 Z36940. 1)为模板，以hipO-F与hipO-R为引物进行扩增反应。将两次扩增反应获得的特异 性扩增片段，分别连接到T克隆载体上，构成的重组质粒，经过浓度测定与调整，浓度分别 为 107copies/mL。阴性标准品灭菌水。实施例2本专利技术试剂盒检测空肠弯曲菌的方法及其验证人工添加1 10CFUU0 100CFU细菌加入225mL Bolton选择性增菌肉汤中，微 需氧条件下，30°C培养3h，然后37°C培养2h，最后42士 1°C培养19 43h，获得增菌液。(1)用本专利技术试剂盒进行检测用细菌核酸提取试剂盒提取增菌液及阳性对照菌株的DNA，取上述配制的空肠弯 曲菌PCR MIX反应液、Taq酶系，室温融化并振荡混勻后，10，OOOrpm离心10s。按照每个检 测反应体系24yL PCR MIX和2yL Taq酶加入一适当体积的干净PCR扩增管或孔中，充分 混勻离心然后加入4μ L增菌液的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种空肠弯曲菌荧光定量ＰＣＲ基因检测试剂盒，包括如下试剂：　　（１）ＰＣＲ　ＭＩＸ反应液：５×ＦＱ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ、浓度为１０ｕＭ的引物混合物、浓度为１０ｕＭ的ＴａｑＭａｎ探针混合物、浓度为１０ｍＭ的ｄＮＴＰｓ和ｄｄＨ↓［２］Ｏ，其中所述引物混合物中含有：１６Ｓ　ｒＲＮＡ上游引物Ｆ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ下游引物Ｒ、上游引物ｈｉｐＯ－Ｆ和下游引物ｈｉｐＯ－Ｒ，ＴａｑＭａｎ探针混合物中含有：１６Ｓ　ｒＲＮＡ－Ｐ和ｈｉｐＯ－Ｐ；　　所述１６Ｓ　ｒＲＮＡ上游引物Ｆ序列为：５’－ＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＴＡＧＧ－３’；　　所述１６Ｓ　ｒＲＮＡ下游引物Ｒ序列为：５’－ＴＴＣＣＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＧＡＡ－３’；　　所述上游引物ｈｉｐＯ－Ｆ序列为：５’－ＴＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧ－３’；所述下游引物ｈｉｐＯ－Ｒ序列为：５’－ＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴ－３’；　　所述１６Ｓ　ｒＲＮＡ－Ｐ序列为：５’－ＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣ－３’，其５’端标记荧光报告基团，３’端标记荧光淬灭基团；　　所述ｈｉｐＯ－Ｐ序列为：５’－ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣ－３’，５’端标记荧光报告基团，３’端标记荧光淬灭基团。　　（２）Ｔａｑ酶；　　（３）阳性标准品和阴性标准品，所述阳性标准品是浓度为１×１０↑［７］ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ的目的片段重组质粒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋原，祝长青，薛峰，栾军，邵景东，陈国强，唐泰山，张常印，张睿，沈崇钰，吴斌，
申请(专利权)人：江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]