本发明专利技术提供了一种检测霍乱弧菌Ｏ１３９的荧光检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒中特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：５′－ＴＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＣＧＴＴＡＴＡＧＧ－３′，下游引物：５′－ＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡ－３′，荧光探针：５′－ＦＡＭ－ＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＴＣ－ＴＡＭＲＡ－３′，其中ＦＡＭ为荧光报告基团，ＴＡＭＲＡ为荧光淬灭基团。本发明专利技术的有益效果主要体现在：细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规ＰＣＲ扩增的假阳性率；可实现对霍乱弧菌Ｏ１３９快速、准确、特异检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种霍乱弧菌0139的荧光检测试剂盒及其检测方法。(二)
技术介绍
霍乱是由霍乱弧菌引起的 一类以腹泻为主要症状的烈性传染病。过去 一直认为只有霍乱弧菌01型能够致病，而非01型只能引起轻微的症状， 不能导致大规模流行。然而，1992年印度和孟加拉国暴发了一种新型非 Ol群霍乱弧菌——0139群引起的霍乱大流行。我国近些年在许多地区也 不同程度出现霍乱弧菌0139引起的大面积疫情，特别是近几年来，0139 群霍乱暴发的比例仍然在不断上升。霍乱弧菌检测的传统方法主要有形态学、生物化学、凝结试验等，这 些检测的周期长， 一般在8~ 10小时以上，对因环境或营养缺乏导致的异 形菌抹(如L型、球型菌林)则不能检测。 一些免疫学方法尽管速度快， 但结果不稳定，只能用于疑似病人的快速初筛，还不能作为确诊依据。 PCR技术虽然能够快速的对病原菌进行诊断，但是具有大量的假阳性结 果存在。研究表明霍乱弧菌Ol和0139型在许多基因结构和组成上都是 高度相似的； 一些毒力因子基因如ctxA和tcpA等均是两种血清型共有的， 因此只对于上述的毒力基因进行检测结果是不精确的；而通过比对发现两 种血清型霍乱弧菌的糖基转移酶基因(LPSgt)序列存在较大差异。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是根据霍乱弧菌0139糖基转移酶基因设计引物和 TaqMan探针，提供一种检测霍乱弧菌0139的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对霍乱弧菌0139快速、准确、特异4企测。本专利技术采用的技术方案是一种霍乱弧菌0139的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性 引物和荧光探针、PCR緩冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶， 所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5 '-TCCTGAAATATTGTTGCGTTATAGG國3' 下游引物5 '画ATCCCTATAGATGTAAGCACTTCA-3' 荧光〗笨4十5 '陽FAM-AAGAAAGATTTGAGATCATTTC-TAMRA醒3' 其中FAM为荧光才艮告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。 本专利技术关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组 成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作霍乱弧菌0139的定性才企 测，也可加入标准品进行定量检测。为达到定量测定的效果，所述试剂盒还包括可霍乱弧菌0139糖基转 移酶基因标准品，所述标准品序列如下tgtaatgatt agaaagaaag ttattgataa atataaaatt aattatgatt taggttataa agatgccgaa gactataaat tttgggtcga tttttcaaaa tatacacttt tttctaatgt tcctgaaata ttgttgcgtt ataggtatca tcaagagagt atatcacgtg tagctgataa taaagaaaat aaagaaagat ttgagatcat ttcaaaaatt caaaatgaag tgcttacatc tatagggatt gtattgacaa atgaaggtgc gaaaaatcat ttcattcttt cacttaatga gcgcattatt aacaatgtaa cagattgtga tatgataaga gcgcatcttt taaaaataag tagttctcaa attgaaagta gccaatttga ttcttctgct atagaaaggc ttatgttaaa aaaatatttt atttatctga ttttatcgat aagaagagat aaagatctga gttatctaaa gatatttgat ttaatgtttt taaaaggtgc ctttttattt ttaaaagata aaatggagca gttttaataa tgacgcttga tatctcagtt gttattcctc tatataataa aaactactct attgtaagat gtttgaattc tgttttatat caaactattt tgccttttga aataattattgttaatgacg gttcgactga tgatagtctc gtt 。以标准品的梯度浓度的DNA ;容液进 行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得 到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA 的拷贝浓度。本专利技术还涉及一种霍乱弧菌0139的焚光定量PCR检测方法，所述 方法如下(1) 4是取待测样本DNA;(2) 取前述特异性扩增引物及特异性探针、PCR緩冲液、脱氧三磷 酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品 DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应， 反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；(3 )选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 ~ 15个循环的荧光 信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线； 若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长， 则判断为阳性。所述阴性对照品可按本领域常规方法选择,通常选择不含靶基因的非 靶细菌，如副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌等。进一步，所述方法同时以梯度浓度的前述标准品的DNA溶液在与样 品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的 对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA 测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的， 本专利技术中PCR反应条件如下95。C变性5分钟，95°C45秒、54。C30秒、72。C30秒，进行35个循环扩增，最后于72。C延伸10分钟后置4。C。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)lxpCRbuffer、 0.3 0.5HM的引物、0.1~0.3 jaM的荧光才笨针、1~5U的DNA聚合酶、0.2~0.4mM的dNTPs,通常取1 2 ju L的模板，反应总体积通常为20~50 n L。本专利技术建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌0139 的方法，并经检测流行病学现场标本，表明该方法切实可行。由于本方法 采用了PCR扩增技术，使得细菌的检测敏感性大大提高，而且由于焚光 探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性 率，使得我们可以在极少的标本中获得足够的信息。本专利技术采用了目前最先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技 术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR 检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竟争性 PCR,基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理， 根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR 产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法 实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步 骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。 随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的 精确定量，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种霍乱弧菌Ｏ１３９的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、ＰＣＲ缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和ＤＮＡ聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下： 上游引物：５′－ＴＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＣＧＴＴＡＴ ＡＧＧ－３′ 下游引物：５′－ＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡ－３′ 荧光探针：５′－ＦＡＭ－ＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＴＣ－ＴＡＭＲＡ－３′ 其中ＦＡＭ为荧光报告基团，ＴＡＭＲＡ为荧光淬灭基 团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张政，金大智，朱水荣，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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