一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法技术

本发明专利技术涉及一种用于志贺氏菌检测的悬浮芯片及其检测方法，该悬浮芯片包括微球载体和固定在载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针是从志贺氏菌筛选的特异性的基因侵袭性质粒抗原Ｈ中的一段ＤＮＡ序列。利用设计的引物将待检样品基因组ＤＮＡ扩增并标记后，利用上述悬浮芯片进行杂交，根据杂交荧光强度，可判断待检样品中是否含有志贺氏菌。悬浮芯片检测灵敏度高，可达到１．１８ｆｇ基因组ＤＮＡ（１ｆｇ相当于２个细菌数）水平，完全可满足临床样本和环境样本检测需要，并具特异性高、操作简单、成本低等特点，易于推广。并采用ＵＮＧ－Ｔａｑ酶ＰＣＲ反应体系，大大降低了ＰＣＲ假阳性结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分子生物学检测领域，具体的是一种应用悬浮芯片技术对志贺氏 菌进行检测。
技术介绍
人类对志贺氏菌高度敏感，只需少于十个菌即可引起人的感染，因此其传 染性强，危害性大。志贺氏菌可通过水、食物传播，引起人类腹泻及痢疾等。据国内相关资料显示，志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位；美国国家 申报疾病监控系统及公共卫生试验信息系统数据显示，每年因志贺氏菌引起的 病例高达448,240例，死亡70例；WHO年度报告指出，在亚非拉各国细菌性腹 泻病例多达1.5-2.5亿人，死亡65万。国家质量监督检验检疫总局2002年第25 号、26号令中明确规定志贺氏菌为食品中必检项目。对志贺氏菌的检测主要包括传统的平板培养、免疫方法及分子生物学技术。国标及行标多采用传统的平板培养或酶联反应(ELISA)的方法。平板培养 方法步骤繁琐，费时费力，且对志贺氏菌缺乏合适的选择性培养基，其它微生 物(如沙门氏菌)竞争性生长，抑制了志贺氏菌，对此菌的检测准确性大大 降低；免疫方法已进行多年的研究，但此方法也面临纯化、富集培养等问题， 还有严重的交叉反应。同时这两种方法每次只能确定或排除一种病原体，不适 合环境监测和流行病学调查。病原菌检测的分子生物学技术，主要分为三类普通PCR技术、荧光PCR 技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性和 假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR技术成 熟，己有大量的学者报道将此技术应用于病原菌检测，但易产生假阴性及交叉 污染等现象，因此至今仍未能在临床中得到推广应用。悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技 术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为"多功能多指标同步分析体系" (Flexible Multiple Analyte Profiling, xMap)， 也称为Multi-Analyte Suspension Array,有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数 据分析系统，即保证了信号质量，又提供高通量的新一代分子检测技术平台。 悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或悬浮芯片系统主要由三部分组成1、微球直径5.6um左右，由聚苯乙烯 构成的，表面带有约108个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联；2、 荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微球分 成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm和712nm 的荧光；3、检测仪因微球直径5.6um，并被荧光标记，采用流式细胞仪技术 原理进行检测。原理每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、 抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合， 再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中 的IOO种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动 将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的 微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头， 一个探头可发射635nm 波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行 定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分 子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目 标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一 起时，两道激光所激发的荧光均可被检测到；若样本中不含目的分子，则仅能 检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两 道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测 目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次 将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过 程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点-1) 应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的 核酸和蛋白分子进行定性定量研究；2) 敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表 面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗 原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏 感性大大提高。3) 重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、 蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；4) 信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问 题，无需洗脱去除本底；5) 高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分 析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；6) 快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是 在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在 35 — 60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检 领U;利用96孔板和自动进样系统，可连续进行nX96个样品的检测。7) 成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应 即可，简单易行；由于是液体储存方式， 一次制备可多次使用，平均每 个指标检测成本仅需2.5 — 5.0元；8) 易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒 的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自 身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种高特异性、高灵敏度、快速、低成本易于推广 的检测志贺氏菌的悬浮芯片技术。本专利技术所提供的检测志贺氏菌的悬浮芯片，包括诊断微球和与此微球耦联 的特异性寡聚核苷酸探针，以及一对特异性的引物。该对引物可扩增志贺氏菌 特异性的侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid antigen H, IpaH)的一段序列， 探针为此序列上的一段序列，引物和探针均具高度特异性。其上下游引物为 B國IpaH-F: 5'-Biotin-CTTGACCGCCTTTCCGATAC-3'; IpaH-R: 5'-ACTCCCGA CACGCCATAGA-3'，并对上游引物Biotin标记。探针序列Ipah-Probe: 5'-NHr(CH2)12-CGGAGATTGTTCCATGTGAGC-3'，并在5'进行NH2-(CH2)12修 饰。本专利技术的另一目的是应用悬浮芯片检测检测志贺氏菌的方法。检测志贺菌所构建的PCR反应体系如下表格1 PCR反应体系<table>table see original document page 6</column></row><table>dTTP、 dUTP (2.5mmol) 各0単B-IpaH-F (1 nmoI/L) 1 plIpaH-R (1 ,1/L) 1 plDNA Polymerase (5 U/(il)' 0.1 (alUracil-DNA Gly呵lase (1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和固定在该诊断微球上的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是志贺氏菌侵袭性质粒抗原Ｈ基因上的一段ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王景林，赵金银，高姗，刘艳华，康琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]