一种同步检测血清样本中多种抗体的蛋白悬浮芯片及系统技术方案

本实用新型专利技术公开了一种同步检测血清样本中多种抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有若干个编码微球，编码微球上包被有相应的捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有操作简便、重复性好等特点。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种同步检测血清样本中西尼罗抗体、土拉抗体、登革热抗体、禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统。
技术介绍
西尼罗热是由西尼罗病毒感染引起的急性传染病。人感染西尼罗病毒多数表现为隐性感染，约140 300个感染者中有I个临床病例。其症状为突然发热、头痛、背痛、肌肉痛等。发烧可表现为双波热，约半数病人可见皮疹。出疹时间在发热期或发热末期。皮疹可为玫瑰样疹或斑丘疹，部位主要在颈背和上肢，持续时间约为I周。可见咽炎和恶心、呕吐、腹泻、腹痛等胃肠道症状。病程一般为3 6天，然后迅速恢复，预后良好，少数病人特别是老年人可表现为无菌性脑膜炎或脑膜脑炎，伴有颈强直、呕吐、神志不安、嗜睡、四肢发抖、痉挛、局部麻痹和昏迷等，病死率较高，达5 12%。土拉菌病是由土拉弗朗西斯菌引起的多种野生动物、家畜及人共患病，亦称野兔热。临床上以体温升高、淋巴结肿大、脾和其他内脏坏死为特征，土拉菌可以被用作生物战中的致病病菌，感染者会出现高烧、浑身疼痛、腺体肿大和咽食困难等症状。登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为百分之33。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。免疫学方法酶联·免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记二抗与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记二抗-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低检测成本。但是悬浮芯片方法是否能够同步检测人血清中的西尼罗抗体、土拉抗体、登革热抗体、禽流感抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种同步检测血清样本中多种抗体的蛋白悬浮芯片系统，该芯片系统包括:芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有若干种编码微球，各种编码微球上分别包被有相应的捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。进一步，所述编码微球包括025号编码微球、028号编码微球、031号编码微球、032号编码微球，其中西尼罗E蛋白抗原作为捕获抗原来包被025编码微球、用土拉fopA蛋白抗原作为捕获抗原来包 被028号编码微球、用登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被031号编码微球、用禽流感H5蛋白抗原作为捕获抗原来包被032号编码微球。进一步，所述待测抗体为血清样品。进一步，所述生物素标记的二抗和/或SPA优选为Biotin-羊抗兔和/或Biotin-SPA。进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。经过大量试验和深入的研究，对同步检测西尼罗抗体、土拉抗体、登革热抗体、禽流感抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点:1、抗原包被量的改进抗原的包被量是成功检测的关键，本技术对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本技术的抗原包被量为0.01 250 μ g/1.25 X IO6个微球，即0.004 1000ng/5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为I μ g/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ L。3、检测的灵敏度及动态范围本技术同步检测几种微生物抗体的蛋白悬浮芯片系统检测土拉fopA抗体的检测灵敏度为5.0ng/mL，并且悬浮芯片系统的动态检测范围为10.9710ng/mL 11.05 μ g/mL ;同步检测几种微生物抗体的蛋白悬浮芯片系统检测登革热2型抗体的检测灵敏度为3.39ng/mL,并且悬浮芯片系统的动态检测范围为258.8ng/mL 66.25 μ g/mL。4、方法的特异性本技术通过选用西尼罗E蛋白、土拉fopA蛋白、登革热E2蛋白、禽流感H5蛋白为包被抗原，分别以兔抗西尼罗E蛋白抗体、兔抗土拉抗体、兔抗登革热2型抗体、兔抗禽流感H5抗体为待测抗体，以生物素化的羊抗兔为捕获抗体。本研究试验证明:各对应的抗原特异性的与对应抗体结合，不与其它抗体发生交叉反应，说明本方法具有良好的特异性。5、样品的检测能力本技术评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中西尼罗抗体、土拉抗体、登革热抗体、禽流感抗体的实用性。附图说明图1为本技术结构示意图；图2为蛋白悬浮芯片方法检测多种病原抗体示意图；图3为蛋白悬浮芯片方法检测兔抗土拉抗体剂量-反应标准曲线图；图4为蛋白悬浮芯片同步检测土拉抗体柱形图；图5为蛋白悬浮芯片方法检测兔抗登革热2型抗体剂量-反应标准曲线图；图6为蛋白悬浮芯片同步检测登革热2型抗体柱形图。具体实施方式如图1至图6所示，本技术一种同步检测血清样本中多种抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体1、加液系统2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同步检测血清样本中多种抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体用于承载待测抗体及其内装有相关缓冲溶液，相关缓冲液中设置有若干种编码微球，各种编码微球上分别包被有相应的捕获抗原，编码微球包括025号编码微球、028号编码微球、031号编码微球、032号编码微球，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，杨永莉，杨宇，孙肖红，曹晓梅，张晓龙，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：实用新型
国别省市：