自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用技术

自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测技术领域。主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素－藻红蛋白组成，所述自身抗原分别与相应的各号微球形成偶联体，以红色激光激发其球形基质上的红色分类荧光，依据其球形基质的色彩不同确定自身抗原的类型；所述生物素化的二抗与链霉亲和素－藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的各种自身抗体的含量。本发明专利技术还公开了所述自身抗体平行检测液相芯片在制备自身免疫性疾病临床诊断检测试剂中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种用于自身免疫性疾病诊断的自身抗体检测平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测

技术介绍
自身免疫性疾病在人群中的发病率是3-5％，尤其是在老年人中发病率最高。这类疾病最普遍的特点是血清中出现自身抗体，而且不同的自身抗体谱可以区分这类疾病中的各种疾病。目前国际上通用的自身免疫性疾病的诊断标准除了相应的临床症状外，其诊断主要还依据患者的血清中检测到自身抗体。风湿病在早期很难诊断，但是在疾病的晚期，全身多个器官系统都会被累及，给病人造成巨大的痛苦，所以需要一种灵敏度高而全面的诊断方法，而目前自身抗体的检测主要采用免疫学方法，常用的有免疫印记、免疫荧光、酶联免疫吸附实验等，这些方法一次只能检测一个抗体，在实际应用过程中对于抗体谱的检测既繁琐又需要相对大量的试剂和临床标本，临床检测费用高，因此如果能将运用新的技术将这些抗体进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物芯片技术的高通量的特点可以实现把多种自身抗体一次性的联合检。液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了可以同时检测多种自身抗体以外，还具有较ELISA反应更加充分的液相反应特点，又具有定量性好，省时省力的优点。因此，研制和开发一种自身抗体平行检测液相芯片是目前临床诊断的必需。
技术实现思路
根据自身免疫性疾病多表现为多样化的自身抗体谱的出现的临床特点，针对现有自身抗体目前采用的ELISA检测、免疫荧光等单个检测一次只能检测一种自身抗体技术的不便和临床诊断的需要，本专利技术要解决的问题是提供一种自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用，为自身免疫性疾病的早期发现、早期诊断和早期治疗提供一种方便的、准确的临床检测方法以及检测试剂盒。本专利技术的自身免疫性疾病平行检测液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球；所述自身抗原是ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白(CCP)，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，α-胞衬蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是经活化的生物素标记的羊抗人IgG；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特异与其相应的自身抗体结合。其中所述ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白(CCP)与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。以红色激光激发球形基质上的红色分类荧光，依据球形基质的色彩不同确定类型；所述生物素化二抗与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的自身抗体的含量。本专利技术共确定了15种用于自身免疫性疾病诊断的自身抗体检测的自身抗原，并利用所述抗原分别检测其相应的抗体，分别是ANAs抗体，dsDNA抗体，SSA/Ro-60抗体，SSA/Ro-52抗体，SSB/La抗体，Jo-1抗体，抗Scl-70抗体、抗PCNA抗体，抗CCP抗体，抗组蛋白抗体，抗着丝点抗体(ACA，RA33抗体)，抗rRNP抗体，抗U1RNP抗体，α-胞衬蛋白抗体，抗角蛋白抗体。本专利技术所涉及的15种自身抗体，是在大量临床应用的基础上，证实确有与自身免疫性疾病的发生有密切关系而选择的。优选的，所述生物素化的二抗是生物素化山羊抗人IgG(H+L)。优选的，所述28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球是经洗涤、活化的羧基微球。生物素化的二抗是用于识别自身抗体的另一类抗体，其作用是将液相芯片微球体结合的自身抗体与检测荧光偶联，间接将结合的标记物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对每种自身抗体的浓度进行定量测定。生物素化山羊抗人IgG(H+L)通过生物素与avidin-R-PE结合，最后通过Luminex100检测系统对每一种自身抗体进行定性定量检测。本专利技术的设计思路是选择自身免疫性疾病产生的自身抗体所针对的抗原，分别与不同色号的微球偶联，制备出可对上述自身抗体进行一次性平行检测的液相芯片，在应用时，加入待检血清，使血清中的自身抗体被微球上的抗原捕获，再与生物素标记的二抗共同孵育，然后与链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PA)反应，通过Luminex100检测系统，实现对上述自身抗体一次性定量检测。本专利技术所述自身免疫性疾病平行检测液相芯片的制备方法，其步骤是(1)自身抗原与微球偶联形成偶联体分别选取28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；以上述顺序分别对应地加入ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白(CCP)，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞衬蛋白，角蛋白；混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育30～120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白(CCP)与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；计数每种微球偶联体的单位体积数，确定浓度，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合； (2)将标记有探针的球形基质即自身抗原与微球偶联的偶联体、报告分子即活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置。得到本专利技术的自身抗体平行检测液相芯片。生物素化二抗的选择优选生物素化山羊抗人IgG(H+L)，用于将链霉亲和素-藻红蛋白结合到微球上。本专利技术所述自身抗体平行检测液相芯片在制备临床检测试剂中的应用。将标记有探针的球形基质即自身抗原与微球偶联的偶联体、报告分子即活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置，探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，将混合物上样到Luminex 10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自身抗体平行检测液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素－藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是２８，３２，３６，３８，４６，４８，５６，５８，６６，６８，７６，７８，８６，８８，９２号微球；所述自身抗原是ＡＮＡｓ、ｄｓＤＮＡ、ＳＳＡ／Ｒｏ－６０、ＳＳＡ／Ｒｏ－５２、ＳＳＢ／Ｌａ、Ｊｏ－１；Ｓｃ１－７０，ＰＣＮＡ，环状聚丝蛋白，组蛋白，ＣＥＮＰ－Ｂ，ｒＲＮＰ，Ｕ１ＲＮＰ，α－胞衬蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是经活化的生物素标记的羊抗人ＩｇＧ；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特异与其相应的自身抗体结合；其中：所述ＡＮＡｓ抗原与２８号微球形成偶联体，ｄｓＤＮＡ与３２号微球形成偶联体，ＳＳＡ／Ｒｏ－６０与３６号微球形成偶联体，ＳＳＡ／Ｒｏ－５２与３８号微球形成偶联体，ＳＳＢ／Ｌａ与４６号微球形成偶联体，Ｊｏ－１与４８号微球形成偶联体；Ｓｃ１－７０与５６号微球形成偶联体，ＰＣＮＡ与５８号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白与６６号微球形成偶联体，组蛋白与６８号微球形成偶联体，ＣＥＮＰ－Ｂ与７６号微球形成偶联体，ｒＲＮＰ７８号微球形成偶联体，Ｕ１ＲＮＰ与８６号微球形成偶联体，α－胞衬蛋白多肽与８８号微球形成偶联体，角蛋白与９２号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高雪芹，张华宁，韩金祥，徐华，
申请(专利权)人：山东省医药生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]