本发明专利技术提供了一种基于生物条码的液相芯片检测系统。该检测系统包括：用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置；用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及液体试剂。本发明专利技术中分别标记了核酸的磁珠和纳米金与靶核酸形成“三明治”夹心结构，通过磁架分离，将纳米金上标记的条码核酸固定，通过二硫苏糖醇释放生物条码实现检测信号的转换与放大。在杂交体系中，分别标记了核酸探针的微球和量子点与条码核酸形成夹心结构，通过检测量子点的液相芯片系统将信号进一步放大，从而实现低丰度靶核酸的定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种基于生物条码的液相芯片检测系统。
技术介绍
核酸的定性和定量检测已成为疾病预测的重要指标。自从southern blot技术出 现之后，衍生出了一系列的检测核酸的技术，特异性强，但灵敏度低，操作复杂；紫外分光光 度法方法简单，但是对于低丰度的核酸，很难达到精确地定量。随后出现的荧光定量PCR技 术也存在着一些弊端，如易形成假阳性，RNA反转录时各样品的误差太大等。近年来，随着 分子生物学的快速发展，出现了一些检测核酸的新手段。纳米粒子-DNA生物条形码这一概念最早是由美国西北大学Mirkin小组于2003 年提出。这种技术不仅可以用于蛋白质检测，也可用于核酸检测。在核酸检测中，以碱基互 补配对为原则，将对低丰度靶核酸的检测转换到成比例扩增的生物条码核酸上，再通过纳 米技术，将与条码核酸部分互补的核酸序列结合到纳米金颗粒上，构成金颗粒探针，捕获条 码核酸后，通过银染法，使生物信号得到进一步的放大。此法不需要靶核酸的扩增，具有与 传统的PCR相当的灵敏度，而且实验结果可以通过目测直接观察到，不需要专门的技术人 员和昂贵的仪器，检测过程在短时间内就能完成，适合于做基层流行病学检测。
技术实现思路
本专利技术的目的对现有靶核酸技术的检测中存在的不足之处做了进一步的改进，提 供了一种用于检测靶核酸的新方法，即一种基于生物条码的液相芯片检测系统。本专利技术所述的一种基于生物条码的液相芯片检测系统，包括用于富集、转换并 放大靶核酸信号的核酸放大装置；用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及液体试剂； 所述的核酸放大装置包括以第一寡核苷酸探针标记的磁珠；以及以第二寡核苷酸探针和 条码核苷酸经巯基修饰并偶联的纳米金颗粒；其中，所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷 酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致在磁场的作用下通过第一寡核苷酸探针-靶核 酸_第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在磁架上，再通过洗涤去除未结 合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸；所述的核酸 检测装置包括以第三寡核苷酸探针标记的聚苯乙烯微球；以及以第四寡核苷酸探针标记 的量子点；其中，第三寡核苷酸探针和第四寡核苷酸探针分别与条码寡核苷酸两端序列互 补配对，以致在液相杂交反应中，形成第三寡核苷酸探针_条码寡核苷酸_第四寡核苷酸 探针的核酸夹心方式，孵育一段时间后，用液相芯片检测仪读出检测结果；所述液体试剂 包括用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，包括100mm Tris-HCl, pH 7. 5、500mm LiCl、 IOmm EDTAU % [w/v]十二烷基硫酸锂、5mm 二硫苏糖醇、IOU RNase抑制剂；以及用于释 放结合在纳米金上条码核酸的转换液，包括0. IM 二硫苏糖醇、0. 15M NaCUO. OlMNaH2PO4, 0. 1% SDS, pH 7. 4。根据本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的进一步特征，所述磁珠浓度为50mg/ml，直径为1-5 μ m ；两种寡核苷酸标记的纳米金粒径在20-100nm之间。根据本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的进一步特征，所述第一寡 核苷酸探针的长度为15-30nt。根据本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的进一步特征，所述第二寡 核苷酸探针的长度为15_30nt，所述条码核苷酸的长度为20-40nt，两种核酸均在一端进 行-SH修饰。根据本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的进一步特征，所述第三寡 核苷酸探针的长度为15_30nt，第四寡核苷酸探针的长度为15-30nt。根据本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的进一步特征，所述微球分 类激光波长623nm，所述量子点的激发波长为400nm。本专利技术的技术原理是标记了探针1的磁珠和探针2的纳米金与靶核酸的两端碱 基序列互补配对，反应在Eppendorf管中进行，通过磁架分离，PBS洗涤除去过量的磁珠和 金颗粒，接着用DTT将标记在金颗粒上经巯基修饰的条码核酸释放出来，成为游离的单链 核酸。磁架分离后，吸取管中的液体加入到液相芯片的反应液中，再依次加入探针3标记的 微球和探针4标记的量子点，探针3和探针4与条码核酸两端的碱基互补配对，孵育一段时 间后，使用液相芯片检测仪读出检测结果。本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统，其特点和优点在于分别标记 了核酸的磁珠和纳米金与靶核酸形成“三明治”夹心结构，通过磁架分离，将纳米金上标记 的条码核酸固定，通过DTT释放生物条码实现检测信号的转换与放大。在杂交体系中，分别 标记了核酸探针的微球和量子点与条码核酸形成夹心结构，通过检测量子点的液相芯片系 统将信号进一步放大，从而实现低丰度靶核酸的定量分析。因此，本专利技术所述的基于生物条 码的液相芯片检测系统的检测结果可靠性高，检测效率高，可用于临床上的高通量、大规模 检测。具体实施例方式实施例一本专利技术所述的基于生物条码的液相芯片检测系统的构建与检测实验本专利技术以甲型流感病毒Hmi亚型的检测为例，构建了基于生物条码的液相芯片 检测系统，并用于甲型流感病毒Hmi亚型的检测。1.探针设计与病毒RNA提取实验中所涉及的探针由上海生物工程有限公司合成。针对Hmi流感病毒的特异性探针的设计从NCBI的Genbank上下载所有甲型流 感病毒Hmi的HA和NA完整的核酸编码序列。分别进行多重比对分析，找出保守序列，然 后根据保守序列使用Primer Premier 5. 0软件设计探针。HA的特异性探针为探针1 :5’ ACT GTT ACA TTC TTT TCT 3’探针2 5’ AAT GAA ACC GGC AAT GGC 3'NA的特异性探针为探针1 5’ AGT TGG TGT TGC TGA TGT 3'探针2 :5，ATA CTG TTG TCT TTA CTG 3，生物条码核酸序列由上海生物工程有限公司合成，序列如下bar-code :5’ AGC TAC GAG TTG AGA ATC CTG AAT GCG ACG 3’其特异性探针为探针3 5’ AAT GTA CGT CGC ATT CAG GAT 3'探针4 :5，TCT CAA CTC GTA GCT AAT CCG 3，毒株及其来源A/ws/33 (HlNl)和A/P2/8/34 (Hmi)由中科院广州生物医药与健康研究院提供；B 型为临床分离毒株由广州呼吸疾病研究所提供；甲型HlNl (2009年流行)由美国疾病控制 及预防中心(CDC)提供。以上毒株的信息可通过NCBI网站的http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/Database/select, cgi ？ go = 1 查找。病毒RNA提取a)200-400ul样本加入0. 5ml Trizol (咽拭子来源或病毒培养液)，反复震荡，抽 吸以利于细胞裂解，室温下孵化5分钟。b)加入0. Iml的氯仿并震荡至乳糜化，室温下孵化10分钟，4°C 12000rpm下离心 15分钟，取上清液，转移至另一 1.5ml EP管。c)加入0. Iml的异丙醇，室温下孵化10分钟，4°C 12000rpm下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于生物条码的液相芯片检测系统，其特征在于，包括： 用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置； 用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及 液体试剂； 所述的核酸放大装置包括： 以第一寡核苷酸探针标记的磁珠；以及 以第二寡核苷酸探针和条码核苷酸经巯基修饰并偶联的纳米金颗粒； 其中，所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致在磁场的作用下通过第一寡核苷酸探针－靶核酸－第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在磁架上，再通过洗涤去除未结合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸； 所述的核酸检测装置包括： 以第三寡核苷酸探针标记的聚苯乙烯微球；以及 以第四寡核苷酸探针标记的量子点； 其中，第三寡核苷酸探针和第四寡核苷酸探针分别与条码寡核苷酸两端序列互补配对，以致在液相杂交反应中，形成第三寡核苷酸探针－条码寡核苷酸－第四寡核苷酸探针的核酸夹心方式，孵育一段时间后，用液相芯片检测仪读出检测结果； 所述液体试剂包括： 用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，包括：１００ｍｍＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、５００ｍｍ ＬｉＣｌ、１０ｍｍ ＥＤＴＡ、１％［ｗ／ｖ］十二烷基硫酸锂、５ｍｍ二硫苏糖醇、１０Ｕ ＲＮａｓｅ抑制剂；以及 用于释放结合在纳米金上条码核酸的转换液，包括：０．１Ｍ二硫苏糖醇、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、０．１％ＳＤＳ，ｐＨ ７．４。...
【技术特征摘要】
一种基于生物条码的液相芯片检测系统，其特征在于，包括用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置；用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及液体试剂；所述的核酸放大装置包括以第一寡核苷酸探针标记的磁珠；以及以第二寡核苷酸探针和条码核苷酸经巯基修饰并偶联的纳米金颗粒；其中，所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致在磁场的作用下通过第一寡核苷酸探针 靶核酸 第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在磁架上，再通过洗涤去除未结合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸；所述的核酸检测装置包括以第三寡核苷酸探针标记的聚苯乙烯微球；以及以第四寡核苷酸探针标记的量子点；其中，第三寡核苷酸探针和第四寡核苷酸探针分别与条码寡核苷酸两端序列互补配对，以致在液相杂交反应中，形成第三寡核苷酸探针 条码寡核苷酸 第四寡核苷酸探针的核酸夹心方式，孵育一段时间后，用液相芯片检测仪读出检测结果；所述液体试剂包括用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，包括100mm Tris HCl、pH 7.5、500mm LiCl、10mm EDT...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾令文，熊业华，葛晨晨，方志远，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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