一种应用悬浮芯片技术检测致病性志贺氏菌方法技术

本发明专利技术涉及一种用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片及其检测方法，该悬浮芯片包括微球载体和固定在载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针是从致病性志贺氏菌筛选的特异性基因侵袭相关位点（ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｏｃｕｓ，Ｉａｌ）基因中的一段ＤＮＡ序列。利用设计的引物将待检样品基因组ＤＮＡ扩增并标记后，利用上述悬浮芯片进行杂交，根据杂交荧光强度，可判断待检样品中是否含有致病性志贺氏菌。悬浮芯片检测灵敏度高，可达到ｆｇ级基因组ＤＮＡ水平，可满足临床样本和环境样本检测需要，并具特异性高、操作简单、成本低等特点，易于推广。并采用ＵＮＧ－Ｔａｑ酶ＰＣＲ反应体系，大大降低了ＰＣＲ假阳性结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分子生物学检测领域，具体的是一种应用悬浮芯片技术对致病性 志贺氏菌进行检测。技术背景悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技 术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为"多功能多指标同步分析体系"(Flexible Multiple Analyte Profiling, xMap)， 也称为Multi-Analyte Suspension Array,有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和 数据分析系统,即保证了信号质量,又提供高通量的新一代分子检测技术平台。 悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或 尼龙膜上，依靠坐标定位进行寻址，而悬浮芯片将检测探针共价交联到不同的 色标微球上，根据色标微球上所带的荧光素进行区分。悬浮芯片系统主要由三部分组成1、微球直径5.6iim左右，由聚苯乙 烯构成的，表面带有约108个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联； 2、荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微 球分成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm 和712nm的荧光；3、检测仪因微球直径5.6um，并被荧光标记，采用流式 细胞仪技术原理进行检测。原理每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、 抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合， 再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的IOO种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自 动将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布 的微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头， 一个探头可发射 635nm波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微 球，进行定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所 带报告分子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定 量检测目标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针 吸附在一起时,两道激光所激发的荧光均可被检测到;若样本中不含目的分子， 则仅能检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件， 分析两道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十 种检测目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样 器依次将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续 分析过程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。 与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点1) 应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目 的核酸和蛋白分子进行定性定量研究；2) 敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球 表面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或 抗原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号， 敏感性大大提高。3) 重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、 蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利 于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；4) 信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的 问题，无需洗脱去除本底；5) 高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分 析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；6) 快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应 是在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度； 在35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标 的检测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行nX96个样品的检 测。7) 成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反 应即可，简单易行；由于是液体储存方式， 一次制备可多次使用，平 均每个指标检测成本仅需2.5—5.0元；8) 易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂 盒的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。 人类对志贺氏菌高度敏感，只需少于十个菌即可引起人的感染，因此其传 染性强，危害性大。志贺氏菌可通过水、食物传播，引起人类腹泻及痢疾等。 据国内相关资料显示，志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位；WHO年 度报告指出，在亚非拉各国细菌性腹泻病例多达1.5-2.5亿人，死亡65万。国 家质量监督检验检疫总局2002年第25号、26号令中规定志贺氏菌为食品中 必检项目。志贺氏菌中70%菌群具致病性，而志贺氏菌的主要检测方法平板培养、 免疫学方法，只能对志贺氏菌进行检测，不能鉴定出是否具有致病性。有关文献报到(Phantouamath B, 2003)，致病性志贺氏菌均具有侵袭相关位点基因 (invasion associated locus, Ial)，在分子水平上实现对Ial基因的鉴定，可有 效鉴定致病性志贺氏菌，为临床、食品生产、环境健康提供参考信息。
技术实现思路
本专利技术目的旨在提供一种检测致病性志贺氏菌的悬浮芯片。本专利技术的悬浮 芯片包括诊断微球和与此微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中该寡核苷酸 探针序列为侵袭相关位点基因(invasion associated locus, Ial)的一段序列。 本专利技术还公开了 一段寡核苷酸探针序列，该序列为 5'-NH2-(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3'，如序列表3所示，并在5' 进行NH2-(CH2),2修饰。此专利技术的悬浮芯片还包括一对特异性的引物，其上游 引物为B-Ial-F: 5'-Biotin- CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'(见序列表l， 进行5'Biotin标记)；下游引物为IpaH-R: 5'- AGGAGGCCAACAATTAT TTCC-3'(见序列表2)。上述引物可扩增包含上述探针序列的一段Ial基因的 序列。应用本专利技术悬浮芯片检测致病性志贺氏菌是通过以下方法进行的。 根据致病性志贺氏菌Ial基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，如 序列表中序列1和2所示，并对其中一条引物进行Biotin修饰；按常规方法制 备待检样本基因组DNA作为模板，使用上述特异性引物进行PCR扩增，同 时使PCR产物带上Biotin修饰；将PCR产物与制备的悬浮芯片杂交，也就是 与耦联在微球上的探针进行杂交，对杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白 标记，然后通过流式细胞仪检测荧光信号。本专利技术的另一目的在于提出一种制备上述悬浮芯片的方法。本专利技术所提供 的制备悬浮芯片的方法，具体包括以下步骤1) 制备寡聚核苷酸探针；2) 用纯水稀释氨基修饰的探针；3) 将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；4) 离心收集微球，加入MES液进行振荡；5) 向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；6) 在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振荡；然后进行温育；7) 再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和固定在该诊断微球上的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是致病性志贺氏菌侵袭相关位点基因（ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｏｃｕｓ，Ｉａｌ）上的一段序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王景林，赵金银，高姗，刘艳华，康琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]