一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法技术

本发明专利技术一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，专用于早熟禾农杆菌介导法基因转化。在愈伤组织诱导培养基中，固化剂－琼脂条的用量增加一倍，即由常规用量８ｇ／Ｌ提高到１６ｇ／Ｌ，获得的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织的数量占诱导产生的愈伤组织总数４０％以上，适合用作农杆菌介导法基因转化的受体材料。用农杆菌介导法已分别将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因（Ｂ．ｔ基因）、葡萄糖氧化酶基因（ＧＯ基因）导入草地早熟禾“大青山”和“超级伊克利”两个品种，获得一批抗虫、抗病转基因工程植株。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，属于植物组织培养方法，专用于农杆菌介导法基因转化的受体材料的培养。二、技术背景草地早熟禾(Poa pratensis)属冷季型草坪草，是温带地区重要的草种之一。由于它具有色泽美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方地区多被用作建坪草种之一。草地早熟禾亦有自身的缺点，如易受病虫危害、不耐炎热等。植物转基因技术的日趋成熟为改良草坪草开辟分子生物学育种新途径。农杆菌介导法具有操作简便、转化效率较高、遗传稳定性好等特点，已被广泛用于双子叶植物。近年来，随着农杆菌介导法基因转化技术的不断改进，已在水稻、小麦、玉米等禾谷类单子叶植物上得到应用。至今，农杆菌介导法在草地早熟禾上尚停留在实验室研究阶段，其主要原因是难以获得颗粒状的胚性愈伤组织。前人的研究工作着重于通过在培养基中附加不同的激素种类及其不同的激素配比组合，添加硫酸铜，诱导胚性愈伤组织发生。在通常情况下，白色、半透明、粘状胚性愈伤组织在继代培养过程中逐渐丧失绿苗分化的能力，尤其是在通过农杆菌感染和共培养后彻底丧失植株再生的能力，从而影响草地早熟禾农杆菌介导法基因转化工作的进展。迄今为止，国内外应用农杆菌介导法基因转化技术在草地早熟禾上仅有1例获得成功的报道(柴宝峰等.农杆菌介导的单子叶植物早熟禾的转化[J]，植物学报，2003，45(8)966～973)。该文献主要侧重于农杆菌介导法基因转化技术方面的研究，未涉及颗粒状愈伤组织的诱导。与前人的工作一样，该作者在诱导培养基上通过附加激素和硫酸铜诱导胚性愈伤组织发生。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的在于克服现有技术培养出的白色、半透明、粘状胚性愈伤组织在继代培养过程中逐渐丧失绿苗分化的能力，不宜用于农杆菌介导法基因转化的缺陷，提供一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，获得的浅黄色、干燥、颗粒状胚性愈伤组织的数量占总的诱导愈伤组织数量40％以上。此类愈伤组织在继代增殖培养、农杆菌感染和共培养、绿苗分化阶段始终保持着颗粒状结构和植株再生的能力，从而保障农杆菌介导法基因转化工作得以顺利进行。技术方案一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，其特征在于，1)材料选用早熟禾的成熟种子为外植体材料；2)愈伤组织诱导培养基基本培养基为MS大量元素、微量元素，B5维生素，蔗糖30g/L；附加激素2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D，上海化学试剂四厂)2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)0.2mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；琼脂条的用量为16g/L；3)培养方法将种子先浸泡在70％乙醇溶液中1～2min，再转到0.1％(质量比)HgCl2溶液中消毒15min，用无菌水冲洗3次后接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26±2℃，在散射光下培养，25d后获得浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，即为适用于农杆菌介导的早熟禾愈伤组织。有益效果 本专利技术与现有技术相比具有如下优点和积极效果在离体培养条件下，通过调控愈伤组织诱导培养基中的渗透压，提高草地早熟禾颗粒状胚性愈伤组织的诱导频率，建立起高频率植株再生受体系统，适合用作农杆菌介导法基因转化的受体材料，为开展草地早熟禾农杆菌介导法基因转化工作提供了重要的基础条件。在愈伤组织诱导培养基中，固化剂—琼脂条的用量增加一倍，即由常规用量8g/L提高到16g/L，获得的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织的数量占诱导产生的愈伤组织总数40％以上。此类愈伤组织在继代增殖培养、绿苗分化及农杆菌感染和共培养过程中，始终保持着浅黄色、干燥、颗粒状结构和植株再生的能力，适合用作农杆菌介导法基因转化的受体材料。使用本专利技术方法培养的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，用农杆菌介导法已分别将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(B.t基因)、葡萄糖氧化酶基因(GO基因)导入草地早熟禾“大青山”和“超级伊克利”两个品种，获得一批抗虫、抗病转基因工程植株。具体实施例方式1.材料和方法1.1试验材料选用草地早熟禾国外品种“超级伊克利”(Poapratensis L.cv.‘TotalEclipse’)和“午夜”(Poapratensis L.cv.‘Midnight’)由北京中种草业有限公司提供；国内品种“大青山”(Poa pratensis L.cv.‘Daqingshan’)由内蒙古畜牧科学院草原研究所提供，为试验材料。1.2愈伤组织诱导培养基基本培养基为MS大量元素、微量元素，B5维生素，蔗糖30g/L。附加激素2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D，上海化学试剂四厂)2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)0.2mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；琼脂条(乘风牌，福建泉州市泉港化工厂)的用量分别设置3组对比试验8g/L、12g/L、16g/L。1.3培养方法以成熟种子为外植体材料，种子先浸泡在70％乙醇溶液中1～2min，再转到0.1％(质量比)HgCl2溶液中消毒15min，用无菌水冲洗3次后接种在愈伤组织诱导培养基上。培养室温度为26±2℃，在散射光下培养。25d后统计愈伤组织的诱导频率。2.结果2.1固化剂用量对颗粒状愈伤组织诱导的影响表1、表2和表3结果显示，培养基中固化剂—琼脂条的用量对颗粒状愈伤组织诱导频率有明显的效果，在琼脂正常用量的情况下3个品种诱导产生的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织仅占诱导愈伤组织总数的3～7％而在琼脂的用量提高一倍的情况下，颗粒状愈伤组织占诱导愈伤组织总数的40％以上。在禾谷类作物组织培养里，通常加入一定量的甘露醇提高培养基的渗透压，获得较高频率的胚状体发生。在本试验中，也观察到添加甘露醇能起到提高颗粒状愈伤组织诱导频率的作用，但琼脂的效果明显比甘露醇的效果好。2.2颗粒状愈伤组织的植株再生能力从诱导愈伤组织培养基上选择出颗粒状愈伤组织进行继代增殖培养。在愈伤组织继代培养基上，浅黄色、干燥、颗粒状结构愈伤组织的外形保持不变，经过连续继代培养3次后转移到愈伤组织分化培养基上，25d后统计绿苗分化频率。表4显示，大青山和超级伊克利两个品种的颗粒状愈伤组织经过连续3次继代培养后，其绿苗分化率保持在30％左右。3.结论以草地早熟禾品种的种子为外植体材料，愈伤组织诱导培养基中的固化剂—琼脂条的用量增加一倍，即由常用的8g/L提高到16g/L，诱导产生的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织占愈伤组织诱导总量的40％以上。颗粒状愈伤组织经过连续继代培养，其绿苗分化率保持在30％左右。颗粒状愈伤组织适用于农杆菌介导法基因转化，获得一批抗虫、抗病转基因工程植株。表1 大青山成熟种子颗粒状愈伤组织诱导情况III培养基固化剂用量 颗粒状 粘状 颗粒状数 颗粒状 粘状颗粒状数(克/升)块数 块数 /总数(％) 块数 块数/总数(％)83 40 6.98 2 37 5.1312 9 29 23.68 8 32 20.0016 18 23 43.90 2126 44.68表2超级伊克利成熟种子颗粒状愈伤组织诱导情况III培养基固化剂用量 颗粒状 粘状 颗粒状数 颗粒状 粘状 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，其特征在于，１）材料选用早熟禾的成熟种子为外植体材料；２）愈伤组织诱导培养基基本培养基为ＭＳ大量元素、微量元素，Ｂ↓［５］维生素，蔗糖３０ｇ／Ｌ；附加激素：２ ，４－二氯苯氧乙酸２．０ｍｇ／Ｌ，６－苄基氨基嘌呤０．２ｍｇ／Ｌ；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整ｐＨ值至５．８；琼脂条的用量为１６ｇ／Ｌ；３）培养方法将种子先浸泡在７０％乙醇溶液中１～２ｍｉｎ，再转到 ０．１％（质量比）ＨｇＣｌ↓［２］溶液中消毒１５ｍｉｎ，用无菌水冲洗３次后接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为２６±２℃，在散射光下培养，２５ｄ后获得浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，即为适用于农杆菌介导法基因转化的受体材料。

【技术特征摘要】
1.一种适用于农杆菌介导的早熟禾组织培养方法，其特征在于，1)材料选用早熟禾的成熟种子为外植体材料；2)愈伤组织诱导培养基基本培养基为MS大量元素、微量元素，B5维生素，蔗糖30g/L；附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤0.2mg/L；培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；琼脂条的用量为16g/L；3)培养方法将种子先浸泡在70％乙醇溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：佘建明，张保龙，倪万潮，何晓兰，陈志一，朱琼，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，浙江绍兴白云建设有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]