一种用大苞雪莲（Ｓ．ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ）毛状根培育雪莲毛状根系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法涉及如下步骤：首先萌发大苞雪莲的无菌种子，取其萌发３天苗龄的绿色子叶的子叶柄，置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，诱导出的毛状根接入筛选培养基上再培养，选择抗Ｋｍ且甘露碱、ＰＣＲ检测显阳性的发根根系，切取根尖１～２ｃｍ用于进行液体扩大培养，收获培养物，培养物再进一步通过干燥、粉碎、有机溶剂分离提取工艺分离、提取制备雪莲黄酮类化合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种大苞雪莲(S.involucrata Kar.et Kir)高产黄酮的毛状根的培养方法，还包括其黄酮的分离、提取、制备工艺方法。
技术介绍
雪莲又名雪莲花，是我国二类珍稀保护植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地的绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地的水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花、大苞雪莲)S.involucrataKar.et Kir；等，但均属于菊科凤毛菊属(Saussurea)雪兔子亚属(SubgenEriocorye)植物，且一般分布于海拔3,500～4,000米以上的高山流石滩上。雪莲是民间常用的一类名贵药用植物。其性温，味微苦，入肝、脾、肾三经，具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能。民间常用于治疗风湿性关节炎，动脉硬化、延缓衰老、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如天山雪莲(又称大苞雪莲)为大体型的雪莲，产量大，质量好；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲；而水母雪兔子(又称水母雪莲花)和三指雪兔子(又称三指雪莲花)，则为小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆雪莲(大苞雪莲)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。雪莲为多年生草本植物，其自然生长缓慢，无节制地采集野生雪莲入药对野生植物资源具有严重的破坏性，而且还会造成生态环境的恶化。为此，我国早已将雪莲列为国家二级保护植物。黄酮类化合物(高车前素、金合欢素、槲皮素等)是雪莲中所含有的一类重要的药用成分，其产量在野生雪莲中不高。为此，针对目前现状迫切需要解决药用雪莲资源问题。目前世界上许多国家如美、英、日、韩及我国的学者都曾对药用植物发根培养进行过大量深入的研究。研究表明，毛状根培养系统不仅生长迅速，遗传稳定，能够大量积累次生代谢物质，而且具有单细胞起源性、激素自主性等特点，这是细胞培养和一般器官培养所不能同时达到的。因此，在几乎所有的双子叶植物以及部分单子叶植物中合成的某些次生代谢物，大多数都可以用毛状根来生产，从而为利用发根培养技术生产重要的次级代谢物(如紫杉醇、青蒿素、长春花碱、多胺类物质、黄酮类物质等药物)开辟了新的途径。目前，国内外关于药用植物毛状根诱导的报道有西洋参、绞股蓝、长春花、直立杂种紫杉、野葛、曼佗罗、芜菁等。然而，由于不同发根农杆菌对不同植物的侵染具有种属的特异性，因此有关雪莲毛状根的诱导及培养在国内外尚未见诸报道。
技术实现思路
针对上述存在的药用雪莲资源的破坏和枯竭问题及雪莲毛状根细胞系的诱导及培养的技术难题，本专利技术的目的在于建立一种大苞雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)毛状根细胞系及毛状根的培养方法，从而利用培养高产黄酮的雪莲毛状根达到产业化生产雪莲黄酮类化合物的目的。该方法具体涉及的步骤如下萌发大苞雪莲的无菌种子。取其萌发2~4天苗龄的子叶柄、叶片、胚根的切段，置于诱导丛生苗培养基上进行培养，获得丛生苗；丛生苗置于苗生长培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根苗的外植体切段，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402、A4侵染，其外植体与感染的发根农杆菌于弱光下共培养，诱导发根。诱导出的毛状根接入筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱、PCR检测呈阳性的发根根系，切取1~2cm根尖用于液体扩大培养，收获大苞雪莲毛状根培养物，从培养物中提取黄酮类化合物。完成上述方法步骤使用的培养基和技术条件诱导丛生苗培养基是MS+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)培养基；丛生苗置MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基，进行单株培养；单株移置诱根培养基为MS+IAA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)；10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根；以在YEB培养基中培养12小时的发根农杆菌(R1601、R1000、LBA9402、A4)为工程菌，侵染在MS(附加1mg/L BA+0.1mg/L NAA)培养基中生长10~15天的再生苗的叶片、茎段和根段及种子萌发产生的子叶、胚轴、胚根外植体。感染后的外植于弱光下共培养2~3天后，用Cef(500mg/L)进行除菌后，弱光下培养诱导发根。14天后在外植体上有毛状根出现，待毛状根长至2~3cm长时，切下置于N6液体培养基(附加500mg/L Cef)中于39℃下，100rpm除菌48hr。切取6~7mm的根尖接入筛选培养基1/2MS(3％蔗糖+100mg/L Km+0.5mg/L GA3)中，弱光培养。10~12d后，切取1~4cm抗Km且甘露碱、PCR检测显阳性的发根根系的根尖进行液体扩大培养，培养基使用液体N6培养基(朱自清等，中国科学，1975，5484-490)，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的20~30倍。本专利技术的另一个目的还在于提供一种从大苞雪莲毛状根培养物中进一步通过干燥、粉碎、有机溶剂分离、提取制备雪莲黄酮类化合物的工艺方法取大苞雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器中，60℃烘干。以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇分离、提取、制备大苞雪莲毛状根培养物中的黄酮类化合物；或直接用新鲜的毛状根培养物浸泡于70％酒精中，进行总黄酮类的提取。本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的15~18％，总黄酮生产率为2.5~3.5g/L。我们通过发根农杆菌R1601诱导大苞雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10~25倍，干燥毛根中所测的总黄酮含量最高达毛状根干重的18％，比种植雪莲和野生生药的3~5％有显著的提高。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到关于用毛状根诱导技术培养生产大苞雪莲黄酮类化合物的报道。因此，本专利技术不仅可以保护有限的野生植物资源免受破坏和维护人类赖以生存的生态环境，而且为走工业化生产大量培养雪莲黄酮类化合物开辟新径。本专利技术与已有的栽培技术相比具有如下优点及积极效果(1)应用大苞雪莲毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物与栽培和野生的植物相比，不但可获得好的质量和高的产量，而且不受自然条件的限制和影响。(2)不需占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。(3)可以通过人工调节与控制毛状根的生长和次生产物的合成；可极大地提高黄酮类化合物的产量(4)该项技术，不使用光照，在暗中进行毛状根培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低，适合工业化生产。附图说明图1大苞雪莲的种子萌发；图2大苞雪莲的再生苗；图3R1601第二次活化生长曲线；图4发根农杆菌R1601感染雪莲茎本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种用大苞雪莲(S.involucrata)毛状根培育雪莲毛状根系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法涉及如下步骤首先萌发大苞雪莲的无菌种子，取其萌发3天苗龄的绿色子叶的子叶柄，置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，诱导出的毛状根接入筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱、PCR检测显阳性的发根根系，切取根尖1~2cm用于进行液体扩大培养，收获培养物，培养物再进一步通过干燥、粉碎、有机溶剂分离提取工艺分离、提取制备雪莲黄酮类化合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的丛生苗诱导培养基进行培养是指用萌发3天苗龄的绿色子叶2mm左右的子叶柄置于MS+BA(2.0mg/L，)+NAA(0.2mg/L，)培养基，在25℃，光强2000lux，24小时光照下的培养。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的苗生长培养基为MS+BA(1.0mgL，)+NAA(0.1/L)，进行单株培养培养条件为25℃，光强2000lux，24小时光照，20天继代一次。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的诱根培养基培养是用(1/2MS+IAA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L，))的培养基，经10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的经发根农杆菌介导进行转化，所指的发根农杆菌有R1601、R1000、LBA9402、...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵德修，付春祥，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。