本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种冬凌草毛状根的诱导方法及诱导表达冬凌草甲素的方法。本发明专利技术以农杆菌ATCC15834侵染冬凌草叶柄外植体20min，即可成功诱导毛状根生成；将冬凌草毛状根在B5培养基培养45d后，提取获得冬凌草甲素。本发明专利技术首次研发出了冬凌草的毛状根诱导方法，并在改方法的基础上建立了高效生产冬凌草甲素的方法，为毛状根培养技术应用于冬凌草甲素规模化生产打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种冬凌草毛状根的诱导方法及诱导表达冬凌草甲素的方法。
技术介绍
冬凌草（Rabdosia rubescens Hemsl. Hara），别名碎米桠，为唇形科香茶菜属植物，于1977年收入《中华人民共和国药典》。冬凌草以茎以上部分干燥入药，具有清热解毒、活血止痛之功效，民间以其治疗噎嗝症(即食道癌或贲门癌)。研究表明，冬凌草主要的药效组分——冬凌草甲素具有广谱抗肿瘤作用，可以抑制多种肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，对白血病、食道癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌等均有抑制作用且无明显毒副作用。我国冬凌草资源分布广泛，但由于冬凌草生长易于受环境影响发生遗传漂变，故变异种类较多，其药效成分——冬凌草甲素属于次生代谢产物，其合成量受种植环境的土壤、气候影响，不同产地冬凌草中药效组分含量有明显差异。同时，药用冬凌草的栽植期长（一年以上）且大量占用农耕地，制约了冬凌草药用产品的开发利用。植物毛状根是利用发根农杆菌Ri质粒诱导外植体后离体培养生成的。毛状根具有生长迅速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定等优点，被认为是植物次生代谢产物规模化合成原材料的优势来源。目前，已有紫草、人参、长春花、甜菜、胡萝卜等植物的毛状根用于工业化生产。发根培养技术将成为药用植物次生代谢物生产的有效途径。而对于冬凌草来说，目前还未有利用毛状根诱导培养体系合成冬凌草甲素的报道。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种冬凌草毛状根的诱导方法。本专利技术的另一个目的是提供一种诱导冬凌草毛状根合成冬凌草甲素的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种冬凌草毛状根的诱导方法，包含以下步骤：以农杆菌ATCC15834侵染冬凌草叶柄外植体20 min，即可成功诱导毛状根生成。作为优选实施方案，一种冬凌草毛状根的诱导方法，具体步骤如下：将冬凌草叶柄外植体接种于预培养固体培养基中进行预培养；将预培养的冬凌草外植体置于发根农杆菌ATCC15834菌液中浸泡20min后取出，擦干外植体表面多余的菌液，接种回预培养固体培养基进行暗培养；然后将外植体转移到除菌生根培养基进行暗培养，即可成功诱导毛状根生成。预培养固体培养基为本领域常规的预培养培养基。优选地，预培养固体培养基为含有0.2mg/L的 MS固体培养基。优选地，所述预培养的培养条件为25℃、暗培养1d。外植体接种回预培养固体培养基进行暗培养的培养条件为25℃、暗培养2d。优选地，所述除菌生根培养基为含400 mg·L-1头孢霉素除菌生根培养基。一种诱导冬凌草毛状根合成冬凌草甲素的方法，包含以下步骤：以农杆菌ATCC15834侵染冬凌草叶柄外植体20 min，即可成功诱导毛状根生成；将冬凌草毛状根在B5培养基培养45 d后，提取获得冬凌草甲素。作为优选实施方案，一种诱导冬凌草毛状根合成冬凌草甲素的方法具体步骤如下：将冬凌草叶柄外植体接种于预培养固体培养基中进行预培养；将预培养的冬凌草外植体置于发根农杆菌ATCC15834菌液中浸泡20min后取出，擦干外植体表面多余的菌液，接种回预培养固体培养基进行暗培养；然后将外植体转移到除菌生根培养基进行暗培养，即可成功诱导毛状根生成；将冬凌草毛状根接种在B5培养基，培养45d后，提取获得冬凌草甲素。更优选地，将冬凌草毛状根按100mL培养基 0.2 g鲜重毛状根的比例接种在B5培养基上。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次研发出冬凌草甲素在冬凌草毛状根中的诱导合成，为毛状根培养技术应用于冬凌草甲素规模化生产打下基础。附图说明图1 农杆菌15834诱导冬凌草毛状根萌发。图2 冬凌草毛状根的诱导及培养。图3 培养第20天的毛状根；1.B5液体培养的毛状根 2. 1/2MS液体培养的毛状根 3.N6液体培养的毛状根 4. MS液体培养的毛状根。图4 培养第45天的毛状根；1为B5液体培养的毛状根 2. 1/2MS液体培养的毛状根 3.N6液体培养的毛状根 4. MS液体培养的毛状根。图5为薄层色谱检测图；1.标准品 2.培养上清萃取液 3.浓缩后培养上清萃取液 4.浓缩后毛状根醇提物 5.毛状根醇提物 6.培养上清。图6 冬凌草甲素标准品HPLC图。图7 冬凌草毛状根醇提物的HPLC色谱图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。冬凌草购自网店( http://ttbcx.taobao.com/?spm=2013.1.100012 6.4.VbJHDT)，经广东药科大学中药学院中药学副教授马鸿雁老师鉴定为济源冬凌草。发根农杆菌ATCC11325于广东菌种保藏中心购买，发根农杆菌ATCC15834由华南师范大学生命科学学院的施和平教授馈赠。冬凌草甲素标准品为美国Aladdin公司产品。其余试剂均为AR级实施例1发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌菌液涂布YNB平板，28℃培养2 d，挑单菌落，接种至YNB培养基中，28℃、160 r·min-1下培养1 d，以1%的接种量将活化后的发根农杆菌接种到锥形瓶中，28℃，160 r·min-1下培养30 h时，即可用于侵染实验。毛状根的诱导：从冬凌草植株上剪下幼嫩的叶片、叶柄与茎部，依次用75%酒精、5 s；0.1%升汞、5 min；无菌单蒸水冲洗7～8次处理后，接种于预培养固体培养基中，25℃、暗培养1 d进行预培养。其后，将预培养1 d的冬凌草外植体置于以MS液体培养基5倍稀释后的发根农杆菌菌液中分别浸泡10、20、30 min后取出，用无菌滤纸擦干外植体表面多余的菌液，之后接种回预培养固体培养基共培养，25℃、暗培养2 d，然后将外植体转移到含400 mg·L-1头孢霉素除菌生根培养基，25℃、暗培养，待毛状根生长至3～4 cm，剥离毛状根进行后续悬浮培养扩增。发根农杆菌ATCC11325和发根农杆菌ATCC15834以10、20、30 min侵染冬凌草叶片，茎部和叶柄。结果显示，发根农杆菌ATCC11325侵染的外植体均未能诱导生根，培养5～6 d，外植体大部分由绿色转为褐化。发根农杆菌ATCC15834侵染叶柄20 min组，暗培养5 d始见叶柄长出白色根状组织，第7 d见大部分叶柄长出根状组织，在部分叶柄同一部位见较多根状物，呈白色、无向地性且多纤毛，符合毛状根的形态及生长特征。发根农杆菌对外植体的发根诱导有一定的选择性，不同发根农杆菌的致病力不同。本研究用发根农杆菌ATCC11325和发根农杆菌ATCC15834分别诱导冬凌草毛状根，结果发现，发根农杆菌ATCC11325侵染不同部位的外植体均无法成功诱导冬凌草毛状根。推测原因可能是发根农杆菌的致根能力有一定特异性，与其所带Ri质粒类型和受体植物的种类有关。此外，也不排除由于采用冬凌草外植体较为幼嫩，发根农杆菌ATCC11325对细胞损伤过大导致无法增殖。外植体部位的选择对诱导毛状根的萌发至关重要，同一菌株在同一植物的不同部位转化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种冬凌草毛状根的诱导方法，其特征在于，包含以下步骤：以农杆菌ATCC15834侵染冬凌草叶柄外植体20min，即可成功诱导毛状根生成。
【技术特征摘要】
1.一种冬凌草毛状根的诱导方法，其特征在于，包含以下步骤：以农杆菌ATCC15834侵染冬凌草叶柄外植体20min，即可成功诱导毛状根生成。2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，具体步骤如下：将冬凌草叶柄外植体接种于预培养固体培养基中进行预培养；将预培养的冬凌草外植体置于发根农杆菌ATCC15834菌液中浸泡20min后取出，擦干外植体表面多余的菌液，接种回预培养固体培养基进行暗培养；然后将外植体转移到除菌生根培养基进行暗培养，即可成功诱导毛状根生成。3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，所述除菌生根培养基为含400 mg·L-1头孢霉素除菌生根培养基。4.一种诱导冬凌草毛状根合成冬凌草甲素的方法，其特征在于，以农杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿，陆幸妍，黄泽波，林晓文，陈俊杰，陈婉琪，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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