检测载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测载体及其制备方法，先将亲和素／链霉亲和素处理疏水性器材表面，之后将结合有生物素的亲水性分子与亲和素／链霉亲和素相结合，从而完成对亲水性分子的包被。亲和素／链霉亲和素可与疏水性器材表面紧密结合，并克服在检测各个步骤中洗涤疏水性器材表面而容易将固定的蛋白质和短肽洗脱的缺陷，提高包被分子的有效性，从而提高了检测结果的重复性。包被后的分子对一般的表面活性剂具有耐受性；稳定性高，易于长期保存；具有预封闭特性，可立即使用，免去常规的封闭步骤等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织化学检测载体，尤其涉及免疫组织化学检测载体，更 具体的是涉及一种亲和素包被的检测载体。
技术介绍
目前，许多领域，如核酸的分子杂交和分离纯化，抗原抗体反应， 靶蛋白的分离纯化，药物筛选等，都可使用酶联免疫吸附检测技术(Enzyme— Linked immunosorbent Assay, ELISA)。 该技术通常使用的 实验器材(如酶标板)主要是聚苯乙烯等疏水性材料，这就必然使实验 器材(如酶标板)表面具有疏水特性。在现有的检测技术当中，主要是 通过与器材表面形成疏水键或离子键的方式，将亲水性物质(如蛋白质、 多肽或核酸等)固定在实验器材(如酶标板)表面。由于不同的亲水性 物质(如蛋白质、多肽或核酸等)的物理性质是不同的，其表面性质也 会有所差异。以蛋白质/多肽为例，由于组成其具体分子的氨基酸种类和 数量不尽相同，其亲水性/疏水性亦有较大的区别。基于聚苯乙烯等疏水 性材料的器材，传统的固定方法虽然简便，但是往往不能使亲水性的目标 物质(如蛋白质、多肽或核酸等)得到充分地固定，尤其是那些呈亲水 性较强的蛋白质、短肽或核酸。因此，为保证检测的灵敏度，需要大量蛋 白质和短肽来固定，不仅增加生产成本，在操作过程中，还容易将固定的 蛋白质和短肽洗脱，致使检测结果重复性较差。另外，通过此传统方法固 定，易引起蛋白质(如抗体)构象改变(变性)，失去与配基(如抗 原表位)的结合能力，致使固定在器材(如酶标板)表面的有效分子数生物素(Biotin) —亲和素(Avidin)系统是近年来出现的一种生物反应放大系统，已广泛应用于免疫学、分子生物学和临床医学等领域中。链霉亲和素(Streptavidin)结合的四聚体SARS抗原肽被应用于对SARS 病毒有特异反应性T细胞水平高低的检测中(CN 1613870A)。由于MHC/小肽四聚体能直接刺激特异性的T细胞的核心蛋白复合物，为此利用链 酶亲和素同时能结合四个分子的特性，将制备得到的纯的标记有生物素的SARS抗原肽与链酶亲和素结合后，直接定量测定人外周血样品中对 SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低。在基因芯片的检测方面，生物素(Biotin) —亲和素(Avidin)反应 放大系统同样得以应用(CN 101162201A)。芯片点加链酶亲和素标记的 纳米级金颗粒，通过链酶亲和素与生物素的特异结合将金颗粒连接到耙标 分子上；然后点加银染试剂，利用银染试剂的氧化还原反应形成的银颗粒 沉积在纳米金上，形成肉眼可见的杂交信号。这种方法与单歩金标银染法 相比，其灵敏度提高10—100倍。因此，生物素(Biotin)—亲和素(Avidin) —直以来应用于反应放 大系统，以使得检测的灵敏度得以有效提高。本专利技术的 一 个目的在于提供 一 种检测载体。 本专利技术的另一个目的在于提供一种检测载体包被方法。 本专利技术的又一个目的在于提供一种亲水性分子的包被方法。 本专利技术的再一个目的在于提供一种使用亲和素包被亲水性抗原的方法。本专利技术的第五个目的在于提供一种经由亲水性分子包被方法包被的 产物在亲和组织化学检测中的应用，尤其是在类风湿关节炎免疫抗体体外 检测中的应用。本专利技术所述的高灵敏度检测载体包括疏水性器材、与其直接结合的亲 和素，以及结合于亲和素上的亲水性配基；所述疏水性器材与亲和素之间 通过疏水相互作用结合；所述配基通过共价连接于其上的生物素非共价地 连接于亲和素四个亚基；所述亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有 机小分子。进一步地说，所述亲和素(Avidin)是一种分子质量为68,000Da， pl 为10.5的一种碱性糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，因此 --般从蛋白清中提取。所述链霉亲和素(Streptavidin)是一种从链霉菌
技术实现思路
(S&eptomycM avWw7)培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60,000Da ，不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生物 素具有高亲和力。进一歩地说，本专利技术所述的疏水性器材选自于塑料或玻璃。 塑料应当理解为全部或部份由碳与氧、氢、氮及其它有机及无机元素 化合而成，在制造的最后阶段成为固体，在制造中某些阶段是液体(塑料 材料在成为最终产品以前，在某些阶段必需要能够流动。)，因而可以加 热或加压力，或二者并用的方式，使其形成各种形状，此庞大而变化多端 的材料族类中的任何一种，如树脂、热固性树脂、纤维素衍生物等，在-条长链的分子结构中存在众多的重复原子或分子。塑料包括人工合成或自 然界有机材料。玻璃应当被理解为易碎的非晶体物质，这些物质可以是透明的也可以 是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸盐融合组成。玻璃还可以认为是-- 类 不具有结晶过程，而是由熔化状态固化而来的材料，大体上由Na20、 CaO 和6Si02化学氧化物组成，具有光学属性和各种机械属性。具体地说，所述的疏水性器材由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳 酸酯或玻璃等制成，具有多孔构造的酶标板。本专利技术所述的亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。 多肽和蛋白质即可以为化学合成，也可以通过生物体自身合成。化学合成 的多肽和蛋白质可以理解为由多个氨基酸通过一个分子的羧基端与另一 分子的氨基端形成酰胺键，并由此一一相连形成的两性(亲水性和疏水性) 聚合物分子；还可以理解为在以氨基酸为主体结构并通过化学反应方式结 合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化(PEGylation)修饰(Adv. Drug deliv. Rev. 28,275 — 299; Adv. Drug deliv. Rev. 54,453 — 609; Adv. Drug deliv. Rev. 60,1 —88)、酰基化(Acylation) (J. Pha腿.Sci. 86,768 —773; J. Pharma. Sci. 86,1365— 1368)和糖基化(Glycosylation) (J. Pharma. Sci. 87,326 — 332; Adv. Drug deliv. Rev. 6,103—131; Adv. Drug deliv. Rev. 13,251—267)等。生物体自身合成的蛋白质/多肽可以理解为由氨基酸组 成的；也可以理解为在氨基酸的骨架上具有化学修饰的，如糖基化等生 物修饰过程。所述多肽至少有两个氨基酸相连构成。多肽和蛋白质的氨基酸指具有 既共价连接氨基又共价连接羧基的不对称中心碳原子的有机分子。核酸包括DNA和各类RNA (tRNA、 mRNA、 rRNA禾n siRNA等)， 还包括以核苷为主体结构并结合有聚合物的大分子，如聚乙二醇化 (PEGylation)修饰、酰基化(Acylation)和糖基化(Glycosylation)等。所述的聚合物为以催化或加成等聚合化反应合成的支链或直链聚合 物或天然存在的聚合物，如纤维素、淀粉、葡聚糖、甲壳素和脂肪酸等。有机小分子指具有亲水性的有C、 H、 O或C、 H、 O、 N、 P、 S等几 种元素组成的分子量小于2000Da的有机小分子，如各类氨基酸、水溶 性维生素(Vitamin)和分子量在200 — 2000Da的聚合物，如聚乙二醇等o本专利技术所述的检测载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测载体，其特征在于包括疏水性器材、与其直接结合的亲和素或链霉亲和素，以及结合于亲和素或链霉亲和素上的亲水性配基；所述疏水性器材与亲和素或链霉亲和素之间通过疏水相互作用结合；所述配基是通过共价连接于其上的生物素以非共价连接于亲和素或链霉亲和素四个亚基；所述亲水性配基选自于多肽、蛋白质、核酸或有机小分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王绍成，朱绍荣，
申请(专利权)人：上海荣盛生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]