本发明专利技术属于免疫化学分析技术领域。公开了一种用于喹噁啉－２－羧酸残留检测的酶联免疫方法及试剂盒，本发明专利技术的方法主要包括药物改造，免疫原、包被原、抗体的制备以及样品前处理和ＥＬＩＳＡ检测方法的建立。本发明专利技术的试剂盒主要由喹噁啉－２－羧酸（ＱＣＡ）特异性抗体、ＱＣＡ标准品、包被有ＱＣＡ与γ－氨基丁酸反应后与卵清蛋白偶联物的酶标板组成。检测时，样品经偏磷酸水解处理，释放ＱＣＡ，ＭＡＸ柱净化，丁胺衍生处理，采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法测定。本发明专利技术的方法及试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点，能同时快速检测大批样品，组织最低检测限为０．６μｇ／ｋｇ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品免疫化学分析
具体涉及一种用于喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留检测的酶联免疫方法及试剂盒，适用于测定食品动物的可食性组织如肌肉、肝脏中卡巴氧残留标示物喹噁啉-2-羧酸(QCA)的残留量。
技术介绍
卡巴氧是喹噁啉类药物，为人工合成的广谱抗菌药，曾作为促生长剂广泛应用于畜、禽养殖中。毒理学研究发现，卡巴氧具有致癌性和致突变性。为了保障消费者的健康和扩大动物性食品的贸易往来，加强对动物性食品中卡巴氧残留的检测是当务之急。卡巴氧在动物体内代谢成喹噁啉-2-羧酸(QCA)，与组织蛋白结合的QCA在体内滞留时间长，被视为卡巴氧的残留标示物，所以分析卡巴氧残留通常分析其代谢产物QCA。目前检测QCA残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)，液质联用(LC-MS)，气质联用(GC-MS)。常用的仪器法(HPLC、LC-MS、GC-MS)所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，分析时间较长，不能进行高通量样品筛选，不适用于广大基层检测单位应用，难于推广。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。目前国内外还未见卡巴氧残留标示物喹噁啉-2-羧酸(QCA)的ELISA检测方法及试剂盒的报道。本专利技术所提供的酶联免疫方法及试剂盒采用间接竞争ELISA法，检测范围较宽，假阳性率低，检测结果可靠、准确，适用于食品动物的可食性组织如肌肉、肝脏中QCA检测，具有非常重要的经济意义和社会意义。
技术实现思路
本专利技术的第1个目的是提供一种喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测方法。本专利技术的第2个目的是提供一种喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测试剂盒。本专利技术的方法和试剂盒专用于动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测，与现有方法相比，本专利技术的方法和试剂盒具有灵敏度高，检测快速，使用方便和检测成本较低等突出优点。本专利技术的技术方案是一种喹噁啉-2-羧酸残留检测酶联免疫方法，其步骤包括药物改造、免疫原与包被原的制备、抗体的制备和样品前处理，其特征在于按照以下步骤(1)将喹噁啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸( ABA)反应得到产物QCA-ABA；(2)将步骤(1)所述的产物QCA-ABA与卵清蛋白相偶联得到包被原；(3)将将步骤(1)所述的产物与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；(4)用步骤(2)的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；(5)用步骤(1)的包被原包被固相载体；(6)将所述的样品先经酸解提取后再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物； (7)将步骤(6)的待测产物进行酶联免疫检测。其中所述的固相载体是酶标板。例如可以采用48或96孔的酶标板作固相载体。所述的衍生试剂是丁胺。所述的催化剂为腈基磷酸二乙酯。一种基于上述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的孔酶标板和设在盒体内的试剂，在酶标板的每孔内，包被有所述的包被原；所述的试剂包括抗喹噁啉-2-羧酸特异性兔多克隆抗体，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，喹噁啉-2-羧酸标准溶液，底物显色A液，底物显色B液，终止液，衍生试剂和催化剂。其中所述的底物显色A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。所述底物显色B液为过氧化氢或过氧化脲。所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。所述的浓缩洗涤液为含有0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述浓缩样品稀释溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。本专利技术酶联免疫方法及试剂盒主要采用间接竞争ELISA法定性或定量检测动物可食性组织如肝、肌肉中QCA残留。其采用高特异性的QCA多克隆抗体，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，组织最低检测限为0.6μg/kg。附图说明图1是本专利技术的免疫原合成路线。图2是本专利技术免疫原紫外图谱。图3是本专利技术喹噁啉-2-羧酸ELISA试剂盒标准曲线。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但不以任何形式限制本专利技术。实施例1、抗原制备1.1免疫原的合成本专利技术的药物改造和免疫原的制备按照附图1所示的技术路线。具体步骤是取酰氯化QCA 0.0348g加入1.0mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h。离心除掉沉淀物，此为A液。将340mg牛血清白蛋白(BSA)溶于5mL生理盐水，此为B液。将A液滴加入B液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.023g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液并用生理盐水透析6天，每12h更换透析液，将所得产物低温冻干，分装保存于-20℃冰箱中，供免疫用。其紫外图谱如图2所示。1.2包被原的合成取酰氯化QCA0.0348g加入1.0mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h。离心除掉沉淀物，此为A液。将180mg卵清白蛋白(OVA)溶于5mL生理盐水，此为B液。将A液滴加入B液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.023g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液并用生理盐水透析6天，每12h更换透析液，将所得产物低温冻干，分装保存于-20℃冰箱中，供包被原。实施例2、抗体的制备 2.1免疫动物采用新西兰大白兔作为免疫动物，以QCA与γ-氨基丁酸反应，反应产物与卵清蛋白偶联为免疫原，免疫剂量为0.5～1mg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫6次，免疫期间要监测血清抗体效价及特异性，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7～10d后采血，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的QCA多克隆抗体。2.2抗体纯化采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体。取兔血清5mL，加入0.06mol/L pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调至pH4.5；于室温下加入辛酸165μL，搅拌30min将血清10000r/min 44℃离心30min，弃沉淀，用0.1mol/L的NaOH溶液将上清液pH调至7.4；向上清液缓慢滴加等量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的终浓度为50％，搅拌20min，4℃10000r/min离心30min，弃上清液，将沉淀溶于少量0.01mol/LpH7.2 PBS中；将沉淀悬浮液移入透析袋，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析过夜，将纯化的血清分装小瓶，置-20℃冰箱保存。2.3抗体效价采用方阵滴定法测得抗体效价为1∶32000。2.4抗体灵敏度采用间接竞争ELISA测定，以抗体IC50值(抑制率为50％所对应的药物浓度)为指标判定抗体灵敏度。将QCA-ABA稀释成0μg/L、0.2μg/L、0.8μg/L、3.2μg/L、12.8μg/L、51.2μg/L系列浓度，测定吸光值，所获得的标准品吸光值的平均值除以0μg/L标准的吸光值再乘以100，绘成一个以QCA浓度(μg/L)为半对数坐标系统的曲线图。结果显示，抗体IC50值为1～10μg/L。2.5抗体特异性采用间接竞争ELISA程序测定，按常规本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种喹噁啉－２－羧酸残留检测酶联免疫方法，包括药物改造、免疫原与包被原的制备、抗体的制备和样品前处理，其特征在于按照以下步骤：（１）将喹噁啉－２－羧酸（ＱＣＡ）与γ－氨基丁酸（ＡＢＡ）反应得到产物ＱＣＡ－ＡＢＡ；（２）将步骤（１）所述的产物ＱＣＡ－ＡＢＡ与卵清蛋白相偶联得到包被原；（３）将步骤（１）所述的产物与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；（４）用步骤（３）的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；（５）用步骤（２）的包被原包被固相载体；（６）将所述的样品先经酸解提取后再过ＭＡＸ柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；（７）将步骤（６）的待测产物进行酶联免疫检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，张泽英，彭大鹏，王玉莲，谢长清，陶燕飞，陈冬梅，黄玲利，戴梦红，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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