抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术涉及抗高尔基体蛋白抗体及其应用。本发明专利技术用重组人ＧＰ７３蛋白免疫动物获得了抗ＧＰ７３多克隆抗体和特异性针对ＧＰ７３的单克隆抗体，并且建立了免疫组化染色及双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法等多种检测临床组织切片和血清样本中ＧＰ７３的方法。实验证实，本发明专利技术获得的多克隆和单克隆抗体可用于制备不同检测方法的多种ＧＰ７３检测试剂。

【技术实现步骤摘要】

-本专利技术涉及抗高尔基体蛋白抗体及其应用。具体涉及抗人高尔基体蛋白(以下简称为 GP73)的特异性单克隆和多克隆抗体，以及用所述的单抗和多抗制备不同检测方法的多种 GP73检测试剂的应用。
技术介绍
目前肝癌的诊断主要依靠血清肿瘤标志物检测、影像学和组织学检查，其中甲胎蛋白(AFP)是目前临床诊断原发性肝细胞癌的最主要实验室指标。AFP虽为诊断肝癌的首选 指标，但其敏感性在33% 85%之间(平均为56.3%)，特异性为30.9%80% (平均为 55.4%)。在肝癌的早期，约有30y。 50。/。的患者AFP呈阴性或水平较低。寻找敏感性高、 特异性强的肿瘤标志物，对于肝癌的早期诊、改善病人的预后是十分必要而迫切的。高尔基蛋白73(Golgi protein 73， GP73)是新近发现的一个分子量为73KDa，定位于高尔 基体上的II型跨膜糖蛋白。采用免疫组化的研究方法证实在人类的上皮细胞有着GP73的 少量表达，而在正常的肝脏中，GP73仅在胆管上皮细胞表达，肝细胞基本不表达。但是 病变的肝组织，特别是在肝癌的早期，GP73呈现过表达并且其表达水平与肝癌的进展程 度相关。最新的研究显示，GP73的胞外段经过蛋白酶切，可以从高尔基体膜上释放到细胞外， 并且采用Western-Blot或是质谱(SELDI-TOFMS)的方法，在肝癌病人的血清中可以检测到 GP73。通过对Western蛋白条带灰度的半定量分析发现，在肝癌特别是早期肝癌的诊断上， 其敏感性为69% 76.9% (平均73%),特异性为75% 92% (平均为83.5%),明显优于 AFP，因此国内外的学者认为GP73有望成为取代AFP的一个新型肝癌诊断标志物。但是 Western和质谱这两种检测方法具有以下缺点 一是不易进行准确定量，第二是费时且操 作不便，因两种方法均过于专业化，只能作为实验室小样本理论研究，不适宜用于大样本、 高通量的筛选和应用型研究，难以将GP73用于临床肝癌病人诊断。相对于Western blot等方法，酶联免疫吸附试验(ELISA)具有敏感性更高、易操作、结 果可以客观定量并且可以重复测定便于动态监测和费用相对低廉等优点，而被广泛应用于临床病人多种肿瘤标志物的血清学检测。目前上市的抗GP73抗体多为多克隆抗体，是采用人工合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫动物后获得的血清。如Santa Cruz Biotechnology, Inc所售的抗GP73的多克隆抗体，是用合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫山羊后获得的。而目前所 见的抗GP73单抗则是针对所有II型高尔基膜蛋白而非特异性针对GP73这一种蛋白所制 备出来的。目前尚无以重组人GP73蛋白为抗原制备抗GP73多抗和单抗，也未见采用双抗体夹 心ELISA检测肝癌病人血清中GP73的报道
技术实现思路
-本专利技术的目的是制备抗GP73多克隆抗体和特异性针对GP73的单克隆抗体，并且将 所制备的单克隆抗体用于GP73的定性及定量检测，特别是用酶联免疫吸附试验等多种不 同方法检测血清样本中GP73的含量。本专利技术分别采用重组人GP73蛋白免疫家兔获得了抗GP73多克隆抗体；免疫小鼠后 经杂交瘤技术和多轮筛选后获得了特异性针对GP73的单克隆抗体(anti-GP73mAb，取名 为6A2)。制备上述抗GP73单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为6A2。已经在中国典型培养 物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC —C200815，保藏时间2008年4月22日。所述抗GP73单克隆抗体6A2，其重链与轻链可变区如SEQ ID NO:l SEQ ID NO:4所示。其中SEQIDNO:l是抗GP73单克隆抗体重链可变区DNA序列； SEQIDNO:2是抗GP73单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。SEQIDNO:3是抗GP73单克隆抗体轻链可变区DNA序列； SEQIDNO:4是抗GP73单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。本专利技术用上述抗GP73单克隆抗体6A2作为捕获抗体，用上述抗GP73多克隆抗体为 检测抗体，建立了检测GP73蛋白的双抗体夹心ELISA法，具体操作方式如下1. 用抗GP73单克隆抗体包被ELISA板，4'C过夜；2. 用PBST洗涤3次后，加入1%脱脂奶粉37'C封闭L5小时；3. 加入用1%脱脂奶粉稀释的GP73蛋白标准品和待测样本，以1%脱脂奶粉为空白 对照室温孵育90min;4. 洗涤3次后，加入抗GP73兔血清(I:IOOO)，室温90min;5. 洗涤3次后，加入1:2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG，室温90min; 洗涤后，加入底物pNPP，室温显色30min，测A405nm的OD值。用本专利技术的抗GP73单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA法检测血清中GP73，具有 如下优点1、 灵敏度高，定量准确本专利技术建立的双抗体夹心ELISA检测血清中GP73含量的最低检测限仅为0.25ng/ml。2、 操作简便、时间短相对于Western等方法，采用夹心ELISA法测定血清中GP73的含量，操作简便、检 测时间短。常规的Western blot需要2天的时间。采用我们建立的夹心ELISA方法，从血 清加入预先包被好的ELISA板，到获得准确的GP73含量值，仅需6小时。3、 便于动态监测可重复测定便于动态监测，因此更具临床应用价值。本专利技术还用上述抗GP73单克隆抗体建立了多种用于GP73检测的其它方法，包括 免疫印迹(Western blot,图1)、免疫沉淀(IP，图2)和免疫组化试验(图3)。利用上述抗 GP73单克隆抗体6A2进行的如下三个试验，均取得了满意的结果1、 Western蛋白印记实验结果表明本专利技术获得的抗GP73单克隆抗体可以很好的识别 重组的His-GP73。2、 通过免疫沉淀实验检测出肝癌患者和正常人外周血液中存在的GP73，证明本专利技术 制备的抗体可以在众多的血清蛋白中，特异性识别天然构象的GP73，并与之结合。3、 免疫组化实验结果显示染色清晰，准确定位于高尔基体上，没有任何非特异性吸 附，并且在免疫组化应用中，抗体的效价高达l : 1000。用本专利技术获得的抗GP73单克隆抗体，利用双抗体夹心ELISA法(酶联免疫吸附试验)、 Western蛋白印记实验、免疫沉淀、免疫组化等实验方法，可以分别制备四种不同的检测 GP73的试剂。如前述，本专利技术用纯化的重组人GP73蛋白免疫家兔获得了抗GP73多克隆抗体。该 抗GP73多克隆抗体也可用于GP73的研究和检测试剂制备。附图说明图1是免疫印迹实验，图中，1是阳性参照(抗His抗体)，2是最后一次免疫的小鼠 血清，3是抗GP73单克隆抗体；图2是血清样本免疫沉淀实验，图中，l.是阴性参照，2.阳性参照，3-5.肝癌病人血清；图3是免疫组化试验，图中，A为低倍镜下所见(放大10倍)，B为高倍镜下所见(放 大40倍)；图4是检测血清中GP73含量的标准曲线，横坐标是吸光度(A405)，纵坐标是GP73 蛋白标准品的浓度(ng/ml);图5是重组人GP73蛋白质谱报告。生物材料保藏信息培养物名称杂交瘤细胞6A2 保藏编号 CCTCC一C200815保藏单位中国典型培养物保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗ＧＰ７３单克隆抗体，其重链与轻链可变区ＤＮＡ序列和氨基酸序列如下所示：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１是重链可变区ＤＮＡ序列；　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２是重链可变区氨基酸序列；　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３是轻链可变区ＤＮＡ 序列；　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４是轻链可变区氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹伯良，张爱霞，
申请(专利权)人：曹伯良，张爱霞，
类型：发明
国别省市：US[美国]