抗炭疽致死因子嵌合单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术制备了一种抗炭疽致死因子人－鼠嵌合中和性单克隆抗体，经体外实验和动物实验证实，该单克隆抗体能够有效中和炭疽致死毒素，并可用于制备治疗人炭疽感染的抗体药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗炭疽致死因子人-鼠嵌合单克隆抗体；本专利技术还涉及所述单克 隆抗体的制备方法；本专利技术还涉及用所述单克隆抗体制备治疗人炭疽感染药物的应用。
技术介绍
炭疽病是一种由炭疽芽孢杆菌引起的急性传染病，人群普遍易感。炭疽毒素是炭疽病的关键致病因子，由三种蛋白成分组成保护性抗原 (protectiveantigen,PA)、致死因子(lethal factor,LF)禾口水月中因子(edema factor,EF)。 单独的LF或EF没有毒性作用，PA与LF结合后形成PA-LF复合物，称为致死毒素(Lethal Toxin, LeTx)。当PA与细胞表面受体结合后形成七聚体孔道，将LF或EF带入细胞内形成 致死毒素或水肿毒素发挥毒性作用。致死因子LF是一种锌依赖性金属蛋白酶，可以降解 ^ffllfi ^^{^/f^iW^i^^^WMWM (mitogen-activated protein kinase kinases, MAPKK)，造成巨噬细胞的大量死亡，导致大量细胞因子如白介素1等释放入体液进而引发 系统性休克造成机体死亡。目前国际上研发最多的是针对保护性抗原PA的中和抗体，或阻断PA与巨噬细胞 表面受体结合，或阻断PA七聚体的形成，或阻断PA与致死因子LF的结合，但PA较易突变， 可能使原本与PA结合的抗体失去中和活性。而针对致死因子LF的中和抗体可更为直接地起到作用。本专利技术人曾制备出一株 可分泌中和LF的高亲和力鼠源单克隆抗体的细胞株，命名为LF8细胞，其分泌的中和LF的 高亲和力鼠源单克隆抗体命名为LF8抗体(Zhao, P.，X. Liang, J. Kalbfleisch, H. _M. Koo, andB. Cao. 2003. Neutralizing monoclonal antibody against anthrax lethal factor inhibitsintoxication in a mouse model. Human Antib. 12 (4) :129_135.),但鼠源抗体对 人体有免疫原性，即产生人抗鼠抗体，对人体造成损伤，极大地限制了 LF8的临床应用。因此，制备抗LF人-鼠嵌合单克隆抗体，可大大降低鼠源蛋白成分，用于制备安全 的治疗人炭疽感染的抗体药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备抗炭疽致死因子(lethal factor，以下简称LF)人-鼠嵌 合中和性单克隆抗体，该单克隆抗体能够用于炭疽致死毒素体外和体内保护，为最终制备 治疗人炭疽感染的抗体药物及相关临床应用提供手段。本专利技术的另一目的是提供应用基因重组技术和抗体工程技术制备抗LF人-鼠嵌 合中和性单克隆抗体的方法。本专利技术用基因重组技术(图1)，将鼠源抗体LF8的可变区基因与人源抗体恒定区 基因偶联，制备重组表达载体，转染Sp2/0细胞，加药筛选并进行单克隆化，酶联免疫吸附 试验筛选(图2)，对筛选结果最好的一个单克隆细胞扩大培养并建立细胞株，命名为小鼠 骨髓瘤细胞株HcLF8 (以下简称为HcLF8细胞)。对HcLF8细胞进行RT-PCR鉴定(图4)和无筛选药物培养上清ELISA鉴定(图5)，证明其能够稳定地分泌抗炭疽致死因子人_鼠嵌 合单克隆抗体，该HcLFS细胞已保藏在中国典型培养物保藏中心。培养上述HcLFS细胞，收集培养上清，经过Protein G柱纯化，获得了抗炭疽致死 因子人-鼠嵌合单克隆抗体，命名为HcLFS抗体。经蛋白电泳证明所得到的HcLFS抗体纯化效果较好，纯度较高，分子量大小与母 本抗体LF8相同(图3)。上述HcLF8抗体，其重链与轻链可变区如SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 4所示。其 中SEQ ID NO 1是HcLF8抗体重链可变区DNA序列；SEQ ID NO :2是HcLF8抗体重链可变区氨基酸序列。SEQ ID NO 3是HcLF8抗体轻链可变区DNA序列；SEQ ID NO 4是HcLF8抗体轻链可变区氨基酸序列。本专利技术制备的抗LF人-鼠嵌合单克隆HcLFS抗体，既保留了鼠源抗体LF8的高亲 和力、特异性与稳定性，又大大降低了鼠源蛋白成分(鼠源性成分降低了 70% )，可应用于 制备的治疗人炭疽感染的抗体药物。通过抗体亲和力测定(图6)、体外保护试验(图7、8)、体内保护试验(图9)对制 备出的上述抗体HcLFS进行了检验，证明其具有如下优点1、针对炭疽毒素有明显的中和保护作用通过体外细胞中和保护试验(见实施例3、4)和裸鼠体内中和保护试验证明(见 实施例5)，HcLFS抗体能够有效地保护细胞，避免炭疽毒素造成的细胞死亡，半数有效剂量 EC50 = 1. 68nM。尤其是在体内裸鼠中和保护试验中，HcLFS抗体能够达到100%的保护率，裸鼠全 部存活，因此该抗体具有良好的临床应用前景，可用于制备炭疽毒素的治疗药物。2、接近天然抗体的结构，安全性好因为HcLFS抗体是人_鼠嵌合全分子抗体，其可变区为鼠抗体成分，恒定区为人抗 体成分，且该抗体为全分子IgG，大大降低了抗体中鼠源成分(约降低70% )。且HcLFS抗体与天然抗体的分子量大小类似(见图3)，稳定性和体内半衰期均优 于小分子抗体，更加接近天然抗体的结构，而天然抗体的结构是最稳定的。大多数人工制备 的小分子抗体都不具备天然抗体的结构。3、具有与鼠源母本抗体相近的亲和力HcLF8的亲和力达到7· 5X 108L/mol (见实施例2)。亲和力是指抗体与抗原结合的能力与强度，亲和力越大，抗体结合抗原的效果就 越强。对鼠源抗体进行改造后通常面临的问题是亲和力明显下降。HcLFS抗体的亲和力约 达到鼠源母本抗体LF8亲和力(l.OlXlOVmol)的75%左右。生物材料保藏信息保藏单位中国典型培养物保藏中心保藏物名称小鼠骨髓瘤细胞株HcLFS保藏编号CCTCCNO :C201040保藏日期2010年4月22日上述保藏的细胞株HcLF8是分泌HcLF8抗体的细胞。 附图说明图1是重组表达载体？4朋604/\与？464622/\构建的琼脂糖凝胶电泳，图中，1与 6是DNA分子量标准，2是PCR扩增的Vh产物，3是重组载体pAH4604/VH用EcoRV/Nhe I双 酶切鉴定；4是PCR扩增的Vl产物，5是重组载体pAG4622/\用EcoRV/Sal I双酶切鉴定。图2是第3次ELISA阳性的8个克隆吸光值柱形图，图中，白色是1 10稀释上 清，黑色是1 100稀释上清，灰色为对照组。图3是HcLFS抗体蛋白电泳图，图中，1是纯化的HcLFS抗体；2是商品化人IgG ；3 是纯化的LF8抗体；4是蛋白质分子量标准。图4是对HcLF8细胞RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图中，1是内参基因GAPDH， 2是Vh基因，3是\基因，4是DNA分子量标准。图5是细胞株HcLFS无药筛选培养上清ELISA鉴定的柱形图，其中纵坐标表示 405nm吸光值(OD4tl5)，横坐标表示细胞株HcLFS无药培养传代数。图6是HcLFS抗体亲和力测定试验，图中，上面一条曲线是抗原LF为4yg/ml的 酶联免疫吸附试验，下面一条曲线是抗原LF为2μ g/ml的酶联免疫吸附试验。图7是用不同浓度HcL本文档来自技高网...

【技术保护点】
小鼠骨髓瘤细胞株ＨｃＬＦ８，其保藏编号为ＣＣＴＣＣ　Ｃ２０１０４０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹伯良，丁贵鹏，
申请(专利权)人：曹伯良，丁贵鹏，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]