一种高尔基蛋白ＧＰ７３的夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种高尔基蛋白ＧＰ７３的夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法，用两株针对ＧＰ７３胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色和标准曲线检测ＧＰ７３的含量。本发明专利技术的ＧＰ７３的夹心ＥＬＩＳＡ定量检测试剂盒包括包被抗体和检测抗体、封闭液、洗涤缓冲液、显色试剂、终止液和标准品，包被抗体和检测抗体为两株针对ＧＰ７３胞膜外区不同表位的单克隆抗体，其识别的蛋白质的氨基酸序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示。本发明专利技术的ＧＰ７３的夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法和检测试剂盒提高了检测ＧＰ７３的灵敏度和特异性，有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肝癌早期诊断血清标志物的一种免疫学检测方法，具体涉及一种高尔 基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
肝脏是人体最大的器官，肝脏疾病也是发病率和死亡率最高的疾病。由于肝脏具 有很强的代偿能力，部分损伤往往无临床表现，导致肝脏疾病潜伏性强，待有临床表现时， 已经是肝病晚期，难以有效治疗。目前，能够在临床上开展的肝功能试验种类繁多，但是每 一种试验只能探查肝脏的某一方面的某一种功能，到现在为止仍然没有能反映肝脏的大部 分功能的指标，因而，往往引起漏检。目前肝癌治疗最有效的手段是手术切除，但由于缺乏 早期诊断手段，其治疗的效果并不理想，65%的肝癌患者发现并确诊时，病情已经晚期，失 去了根治手术的时机，约80%的患者在诊断后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低，这主 要是因为目前尚缺乏有效的早期诊断手段。目前对于肝脏疾病的诊断主要依靠肝功能检测。临床应用较为广泛的肝功能指标 有①反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)。 ②反映肝细胞有无受损及严重程度的指标谷丙转氨酶(AIJT)、谷草转氨酶(AST)、腺苷脱 氨酶(ADA)、胆碱酯酶(ChE)、乳酸脱氢酶(LDH)等。③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的 指标总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆酸(TBA)、血氨(NH)。④对诊断胆汁淤积 指示酶(包括同工酶)有帮助的酶碱性磷酸酶(ALP)、r.谷氨酸转肽酶(GGT)、5_核苷酸 酶(5-NT)。⑤反映肝脏间质成分增生(肝纤维化和肝硬化)的指标III型前胶原氨基端 肽(PIIIP)、III型原胶原(PCIII)、IV型胶原c端原肽(CIV/PC)；层黏蛋白(LN)；透明质 酸(HA)。⑥对肝肿瘤诊断有意义的血清标志物甲胎蛋白(AFP)。然而现行的种种肝功能试验只能反映肝功能的一个侧面，并不能反映肝功能改变 的全貌，到目前为止，仍缺乏令人满意的有效诊断肝脏疾病的早期检测手段。因此，本领域 迫切需要开发一种新的有效检测肝脏异常的方法。GP73，又名Golml或Golph2，是主要定位在高尔基体上一种蛋白质，是一个II型 跨膜蛋白，具有5个糖基化位点，分子量约45KD，糖基化后约为73KD，其在GeneBank中的序 列号为51280。该蛋白基因序列保守，从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白，功能相当保守， 在正常人肝脏组织表达量很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却大量表达。国外的相关研究 认为，GP73在肝癌患者体内表达量会很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝损伤患者与健康人的 GP73含量比较低，所以将其作为肝癌早期诊断标志物；目前只有免疫印迹检测GP73的方 法，还没有酶联免疫法检测GP73 ；免疫印迹方法操作繁琐，灵敏度和特异性都没有酶联免 疫法高。而在我们的研究中显示，病毒性肝炎，肝硬化和肝损伤患者的SGP73含量也明显高 于正常人，因此提出将GP73作为肝脏异常的标志物。根据专利技术人所进行的资料检索，国内外尚无其他有关检测GP73双单抗夹心ELISA方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种快捷、灵敏、稳定的GP73定量检测方法，以弥补 现有技术的不足。为实现上述目的，本专利技术的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法采用两株 针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色 检测GP73，通过标准品制备的标准曲线确定GP73的含量。优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的序列。优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的 氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的序列。本专利技术获得的识别SEQ ID NO 1的单克隆抗体有三株，分别命名为1F2，1A6和 5F10 ；识别SEQ ID NO 2的单克隆抗体有两株，分别命名为5B12和9D2。通过配对实验，选 择出适合夹心 ELISA 检测 GP73 的最佳 HiAb1-HiAb2 配对有 5B12-5F10 ；5B12-1A6 ；5F10-1A6。所述的包被抗体HiAb1的浓度为1 5 μ g/mL。所述的检测抗体HiAb2的浓度为5 10 μ g/mL，所述检测抗体的稀释液为磷酸盐缓 冲液，磷酸盐缓冲液含体积百分比浓度为5%的小牛血清，质量百分比浓度为1 3%的聚 乙二醇(PEG)和体积百分比浓度为0. 1 0. 5%的吐温20 (Tween20)。所述的检测抗体为标记辣根过氧化物酶HRP的抗体。所述的底物显色剂为3，3' 5,5' _四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。具体来说，本专利技术的GP73的夹心ELISA定量检测方法采用针对GP73胞膜外区不 同表位的单克隆抗体(HiAb1)替代一株mAb与兔多抗的搭配，采用HRP-HiAb2替代兔多抗及同 HRP-羊抗兔抗体的结合反应；制备了多株可识别GP73胞膜外区不同表位的mAb，并通过交 叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配，然后对工作条件进行了优化，通过简化的实 施步骤测得标本GP73水平。其中包被抗体为HiAb1，检测抗体是HRP标记的HiAb2株。优化的工作条件是①包被的HiAb1的工作浓度为5 μ g/mL ；②标准品为GP73融合蛋白，标准品的最高工作浓度约为0. 1 μ g/mL，倍比稀释11 个浓度梯度，空白对照用样本稀释液。③HRP-HiAb2 的稀释液为3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS，最佳工作浓度为 IOug/ HiL(按照mAb5F10的量计算)，PEG为质量百分比浓度，Tween20是体积百分比浓度。④底物显色TMB-H2O2单组分显色液所简化的实施步骤是①用包被液稀释包被HiAb1，加入96孔酶标板，100 μ L/孔，保湿，4度过夜；其中，包 被液为ΡΗ9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液。②用洗涤液洗板3次，加入工作浓度的封闭液，37度孵育2h ；其中，以含0. 1 %的 Tween20的PBS作为洗涤液。③用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品GP73融合蛋白和待测标本，100 μ L/ 孔，37度孵育Ih;④洗板3次，加入工作浓度的HRP-mAb2，100 μ L/孔，37度孵育Ih ；⑤洗板3次，以TMB底物显色，100 μ L/孔，室温避光显色IOmin ；⑥IM H2SO4终止；测定0D450nm的吸光值A ；⑦以标准品的A值和相应浓度制作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比， 计算待测标本的GP73含量。本专利技术的第二个目的在于提供一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂 盒，该试剂盒包括包被抗体和检测抗体、封闭液、显色剂、终止液、洗涤液、标准品，所述包 被抗体和所述检测抗体为两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，所述标准品为 GP73蛋白。优选的，所述检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，所述显色剂为3， 3' 5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。所述的封闭液为含5%的小牛血清，0. 1% 吐温20 (Tween20)和0.01%防腐剂的磷酸盐缓冲液。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高尔基蛋白ＧＰ７３的夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法，其特征在于，用两株针对ＧＰ７３胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测ＧＰ７３，通过标准品制备的标准曲线确定ＧＰ７３的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，古艳丽，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]