使用外切糖苷酶对N-聚糖进行表征制造技术

本披露提供了用于分析Ｎ－聚糖类的结构和／或组成的方法。此类方法经常涉及用多种外切糖苷酶来消化Ｎ－聚糖。在一些实施方案中，Ｎ－聚糖是用多种外切糖苷酶同时进行消化。在一些实施方案中，Ｎ－聚糖是用多种外切糖苷酶顺序地进行消化。在一些实施方案中，根据本披露的方法涉及将已经使用多种外切糖苷酶同时进行消化的Ｎ－聚糖类的切割产物与已经使用多种外切糖苷酶顺序地进行消化的Ｎ－聚糖类的切割产物进行比较。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用外切糖苷酶对N-聚糖进行表征相关申请的交叉引用本申请要求2007年4月16日提交的美国临时申请序列号60/923,688的优先权，其全部内容通过引用结合在此。背景糖蛋白的糖基化作用模式经常在该糖蛋白的功能中发挥重要的作用。仅给出一些实例糖蛋白的糖基化作用模式会影响其正确地折叠的能力，其稳定性(例如，对蛋白质水解和/或其他的降解的耐受性)，催化活性、药效学和/或药物代谢动力学特性，和/或糖蛋白与其他的分子适当地进行相互作用的能力。可替代地或额外地，糖蛋白的糖基化作用模式可以影响这种糖蛋白的传送和靶向。例如，糖蛋白的糖基化作用模式会影响该糖蛋白是否仍然是细胞内(包括，例如该糖蛋白正确地靶向适当的亚细胞区室或多个区室)，该糖蛋白是否会是膜结合的和/或该糖蛋白是否会从细胞中分泌出来。目前的方法经常不能检测到在多种聚糖的一个群体中以低水平存在的几种聚糖。主要的几种聚糖会阻止以低水平存在的几种聚糖的检测和识别。此外，目前的方法通常不能对多种聚糖的一个群体中的几种单个的聚糖的相对水平进行精确地定量。目前的方法可能不能检测多种聚糖的一个群体中的非标准化的连接。因此，需要对在多种聚糖的一个群体中以低水平存在的几种聚糖进行检测的方法。需要对多种聚糖的一个群体中的几种单个的聚糖的相对水平进行定量的方法。概述本披露提供了对N-聚糖的组成和/或结构进行分析的方法。在此所说明的方法可以用来分析N-聚糖制品(例如，多种N-聚糖的一个混合物)，并且用来测定在制品中特定的结构基团和/或不常见的修饰作用(例如，核心或触角海藻糖、乳糖胺扩展物、高甘露糖以及杂合的聚糖，硫酸化作用以及磷酸化作用)的相对水平。在此所说明的方法总体上可以涉及以下步骤获得一种N-聚糖制品；用外切糖苷酶的酶类对N-连接的聚糖进行消化以便特异性地从非还原性末端对单糖进行切割；并且分析这些切割产物。将使用外切糖苷酶的酶类的多种处理(例如同时的以及不同的顺序处理)的结果进行比较可以提供有关聚糖结构的出人意料的信息，例如可以鉴别出在一种N-聚糖制品中以非常低的水平而存在的几种聚糖。 聚糖制品可以通过本领域内任何一种可供使用的方法而获得。总体而言，获得一种N-聚糖制品包括以下步骤(1)获得一种糖蛋白或其他的结合糖(glycoconjiigate)制品；并且(2)从该结合糖制品中获得一种N-聚糖制品。结合糖(例如糖蛋白)制品可以从任何一种来源中获得，包括但不限于，治疗性配制品、商业性生物产品、以及生物样品。 在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白群体并且从该糖蛋白群体的这些糖蛋白中移出N-聚糖而获得一种N-聚糖制品。在一些实施方案中，N-聚糖可以与一种可检测的标记物(例如，荧光的和/或放射性的部分(moiety))相缔合。 在一些实施方案中，使用一种或多种外切糖苷酶对多种N-聚糖群体进行消化，并且对消化产物的结构和/或组成进行分析。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割了一种具体类型的糖苷连接(glycosidic linkage)。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割了多于一种具体类型的糖苷连接。根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。 根据本披露，N-聚糖群体可以使用任何外切糖苷酶进行消化。在一些实施方案中，通过将多种N-聚糖的一个群体经受多种外切糖苷酶的处理而对N-聚糖进行消化。例如，多种N-聚糖的一个群体中可以经受2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、或更多种外切糖苷酶的处22理。在一些实施方案中，同时给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，顺序地给予多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，改变所给予的外切糖苷酶的身份揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息。在一些实施方案中，改变所给予的多种外切糖苷酶的顺序揭示了有关N-聚糖的结构和/或组成的信息。 在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖结构和/或组成的信息，该信息不同于用同一组外切糖苷酶同时进行消化所揭示的信息。在一些实施方案中，使用多种外切糖苷酶进行顺序消化揭示了有关N-聚糖结构和/或组成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时进行消化所揭示的信息相同。 在一些实施方案中， 一旦一种外切糖苷酶的处理已经执行完成，就对所切割的聚糖的结构和/或身份进行分析。在一些实施方案中，至少一种样品可以在外切糖苷酶的处理过程中(例如，在完成该外切糖苷酶处理之前的任何时间点)从该聚糖制品中被移出。在一些实施方案中，在至少所移出的样品之一中对所切割的聚糖的结构和/或类别进行分析。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在所移出的样品中的一种或多种中所切割的聚糖的结构和/或功能与在至少一种其他的所移出的样品中所切割的聚糖的结构和/或功能进行比较。在一些实施方案中，该分析步骤包括将在所移出的样品中的一种或多种中所切割的聚糖的结构和/或功能与在一种参比样品中所切割的聚糖的结构和/或功能进行比较。 已消化的N-聚糖的结构和组成可以通过任何一种可供使用的方法进行分析(例如色谱方法、质谱法、核磁共振、毛细管电泳法、等等)。在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的几种N-聚糖。例如，根据本披露，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的几种N-聚糖小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1°/。、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、或小于0.1%。 在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中以低水平存在的具体的连接(linkage)。例如，23根据本披露，在此所说明的方法允许用于检测在多种N-聚糖的一个群体中按照以下水平存在的具体的连接小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5°/。、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25°/0、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。 在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测多种N-聚糖的一个群体中的几种单个的N-聚糖的相对水平。例如，可对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了在多种N-聚糖的一个群体中每个N-聚糖种类的相对百分比的量。 在一些实施方案中，在此所说明的方法可以用来分析作为治疗剂(例如，干扰素、集落刺激因子、血液凝固因子、等等)而使用的糖蛋白的糖基化作用模式。如本领域的普通技术人员应当理解，这些治疗性糖蛋白试剂的糖基化作用模式可以潜在地影响其治疗特性。这样，对所感兴趣的一种已表达的糖蛋白的糖基化作用模式进行精确表征是重要的。在一些实施方案中，根据本披露的方法在此类治疗性糖蛋白的糖基化作用模式的精确表征方面是有用的。 在一些实施方案中，所感兴趣的治疗性糖蛋白产生于细胞中并且在产生之后从该细胞中分泌出来。根据本披露的方法可以用于预测此类经分泌的治疗性糖蛋白的糖基化作用模式。 在一些实施方案中，根据本披露的方法可以用于监测糖蛋白在其通过细胞进行生产的过程中的糖基化作用模式。例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，包括以下步骤：　提供一种聚糖制品；　将该聚糖制品的一个第一样品经受一个第一外切糖苷酶操作；　使该聚糖制品的一个第二样品经受一个第二外切糖苷酶操作，其中该第二外切糖苷酶操作不同于该第一外切糖苷酶操作并且进一步地其中 该第一以及第二外切糖苷酶操作选自下组，其构成为：　没有进行处理；　顺序地进行处理；以及　同时地进行处理；　对该第一以及第二外切糖苷酶操作的切割产物进行表征；以及　将该第一外切糖苷酶操作的这些切割产物的表征结果与 该第二外切糖苷酶操作的切割产物的表征结果进行比较，从而确定该聚糖制品的至少一个糖基化作用的特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：IC帕森斯，DA布里克，CJ鲍斯克斯，L蒂鲁尼拉坎塔皮拉伊，BE柯林斯，
申请(专利权)人：动量制药公司，
类型：发明
国别省市：US[]