蛋白质的测定方法与蛋白质检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质测定方法，该方法利用酶比色法及酶联法技术测定蛋白质含量。本发明专利技术还涉及蛋白质测定试剂盒。本发明专利技术的测定方法具有专一特异性、灵敏度高、误差小，因此本发明专利技术的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于含有蛋白质的各种产品，尤其是食品的分析。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质的测定方法与蛋白质检测试剂盒
本专利技术涉及食品及医学检验测定
，更具体地，本专利技术涉及蛋 白质测定方法及其试剂盒。
技术介绍
蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量约16%,而三聚氰胺的 含氮量约66% 。目前采用的蛋白质测定方法凯氏定氮法是通过测定样品 中的含氮量，而不是通过直接测定蛋白质来反映蛋白质含量。由于现有食 品和饲料蛋白质含量测定方法存在的这种没有专 一特异性的缺陷，使用含 氮量高的三聚氰胺来提高虚假蛋白质含量的成本，是使用实际蛋白原 料的1/5,于是一些人故意将三聚氰胺用作食品和飼料添加剂，抬高检测食 品和饲料中的蛋白质含量，欺骗国家质检部门和消费者。因此，需要一种 具备专一特异性的能够直接测定食品和饲料中的蛋白质含量的方法，本发 明人经过大量试验研究，终于做出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具备专一特异性的蛋白质的测定方法。 本专利技术的另 一个目的是提供一种蛋白质检测试剂盒。 [技术方案]本专利技术涉及一种蛋白质的测定方法，该方法利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction )技术，通过测量 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定蛋白 质含量。本专利技术的蛋白质测定方法的基本原理如下 蛋白质 蛋白酶> 氨基酸氨基酸+水+辅酶 氨基酸脱氢酶i 含氧酸+氨+还原型辅酶这种方'法应用蛋白酶(protease; proteinase; peptidase; EC 3.4家》矣)酶 (偶)l关氨基酸脱氢酶(amino-acid dehydrogenase; EC 1.4.1.5; EC 1.4.99.1 )酶促反应比色终点法。蛋白质在蛋白酶的作用下进行酶解反应产生氨基酸， 再通过(偶)联合氨基酸脱氩酶的作用，将辅酶(在340nm处没有吸收峰) 还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，这样通过测定还原型辅酶 在340nm处吸光度上升程度就可以测定蛋白质的含量。所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、 NAD+或thio-NAD+的辅酶。 所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、 a,(3，Y，5-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、 激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外 肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶。 氨基酸的检测方法很多，本公司已经就使用酶法测定氨基酸的方法提 出了 80多项专利技术专利申请，因此氨基酸的检测不仅限于使用氨基酸脱氢 酶，也可以是本公司所申请的80多项氨基酸测定方法的专利技术专利的任何一 种。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种蛋白质的测定方法。该蛋白质测定方法的步骤如下A、 样品准备1 )标准样品的制备将一定量的纯蛋白溶于水或緩沖液中，再将蛋白浓度调整到10-100 克/升，得到的溶液作为标准样品；2) 待测样品预处理以重量计按照1/5-1/500比将固体蛋白样品溶于水或緩冲液中作为待测 样品；含有蛋白的液体样品作为待测样品可以直接用于后续步骤；3) 空白样品所述的水或緩沖液作为空白样品，其蛋白质浓度为0克/升；B、 试剂溶液的制备分别移取或称取緩沖液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、蛋白酶、辅酶，然6后将它们混合均勻，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是40 — 500 mmol/L、 0.01 — 7mol/L、 1000 - 80000U/L、 1000 — 80000U /L、 0.2-5mmol/L;所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、 oc，(3,y,5-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、 激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外 肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶；所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、 NAD+或thio-NAD+的辅酶。C、 待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/300 进行混合，在温度36-38。C下反应2-12分钟，在主波长340nm与副波长 405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、 在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间 的变化；E、 在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水或缓冲液作为 空白溶液的吸光度随时间的变化；F、 数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据 下式计算得到蛋白质的含量△A (样品)-AA (空白)蛋白质含量=-x标准浓度(克/升)△A (标准)-AA (空白)式中△A (样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化； △A (标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化； △A (空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化。 根据本专利技术，在所述的蛋白质测定方法中，所述的緩沖液应该理解是 能够使其测定介质的pH基本保持稳定(一般是6.5 - 8.5)的溶液。如果该pH 高于8.5或pH低于6.5，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。根据本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术使用的所述緩沖液选自三(羧 曱基)氨基曱烷一盐酸緩沖液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓沖液、硼 酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液、咪唑/盐酸緩沖液或2-氨基-2-曱基-1-丙醇緩冲液、2-氨基-2-甲基-l-丙醇缓冲液、双甘氨肽缓冲液或PBS缓冲 液。优选地，所述的緩沖液例如选自三(羧曱基)氨基曱烷一盐酸(Tris-HCl) 緩沖液、磷酸盐緩沖液或PBS緩沖液的緩冲液。更优选地，所述的緩冲液例如选自三(羧曱基)氨基曱烷一盐酸 (Tris-HCl)緩沖液或磷酸盐缓沖液的緩冲液。根据本专利技术，在所述的蛋白质测定方法中，所述的稳定剂应该理解是 一种能保护试剂中的介质(底物)与酶不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月， 甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持 数小时，顶多数天，就会失去活性而不再具备检测性能。在本专利技术中，所 述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试 剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。根据本专利技术的另一种优选实施方式，本专利技术使用的所述稳定剂是一种 或多种选自硫S吏铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、丙二醇、甘油 或氯化钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵或甘油的稳定剂。在本专利技术中，使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样 品与所述空白溶液由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下 进行测定反应温度37r,反应时间IO分钟，测试主波长340nm,测试副波长 405nm,待测蛋白质样品与试剂的体积比例为1/10-1/300,计量方法为两点终点法，反应方向为正反应，延迟时间0分钟，4企测时间5分钟。在本专利技术中，所述的纯蛋白是酪蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：　Ａ、样品准备：　１）标准样品的制备　将一定量的纯蛋白溶于水或缓冲液中，再将蛋白浓度调整到１０－１００克／升，得到的溶液作为标准样品；　２）待测样品预处理　以重 量计按照１／５－１／５００比将固体样品溶于水或缓冲液中作为待测样品；液体样品作为待测样品可以直接用于后续步骤；　３）空白样品　所述的水或缓冲液作为空白样品，其蛋白质浓度为０克／升；　Ｂ、试剂溶液的制备：　分别移取或称 取缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、蛋白酶、辅酶，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是４０－５００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１－７ｍｏｌ／Ｌ、１０００－８００００Ｕ／Ｌ、１０００－８００００Ｕ／Ｌ、０．２－５ｍｍｏｌ／Ｌ；　其中所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、α，β，γ，δ－糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、Ｎ－外肽酶、Ｃ－外肽酶、蛋白酶Ａ、 蛋白酶Ｋ、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶；　所述的辅酶是一种或多种选自ＮＡＤＰ↑［＋］、ＮＡＤ↑［＋］或ｔｈｉｏ－ＮＡＤ↑［＋］的辅酶；　Ｃ、待测样品与在步骤Ｂ）得到的试剂溶液按照体积比１／１０至１／３００进行混合，在温度３６－３ ８℃下反应２－１２分钟，在主波长３４０ｎｍ与副波长４０５ｎｍ下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；　Ｄ、在与步骤Ｃ）同样的条件下测定步骤Ａ）标准样品的吸光度随时间的变化；　Ｅ、在与步骤Ｃ）同样的条件下测定在步骤Ａ）使用的水或缓冲 液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；　Ｆ、数据处理　由步骤Ｃ－Ｅ）所述测定的主波长３４０ｎｍ的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到蛋白质的含量：　＊＊＊　式中：　△Ａ（样品）表示步骤Ｃ）得到的待测样品的吸光度变 化；　△Ａ（标准）表示步骤Ｄ）标准样品的吸光度变化；　△Ａ（空白）表示步骤Ｅ）得到的空白溶液的吸光度变化。...

【技术特征摘要】
1、一种蛋白质的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、样品准备1)标准样品的制备将一定量的纯蛋白溶于水或缓冲液中，再将蛋白浓度调整到10-100克/升，得到的溶液作为标准样品；2)待测样品预处理以重量计按照1/5-1/500比将固体样品溶于水或缓冲液中作为待测样品；液体样品作为待测样品可以直接用于后续步骤；3)空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其蛋白质浓度为0克/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、蛋白酶、辅酶，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是40-500mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、0.2-5mmol/L；其中所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、α，β，γ，δ-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶；所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、NAD+或thio-NAD+的辅酶；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/300进行混合，在温度36-38℃下反应2-12分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到蛋白质的含量式中△A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；△A(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化；△A(空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化。2、 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析 仪测定时待测样品、所述标准样品与所述空白溶液由该分析仪在设定条件 下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为二点终点法，温度 37°C,反应时间10分钟，测试主波长340nm,测试副波长405nm,待测蛋 白质样品与试剂的体积比例为1/10-1/300,反应方向为正反应，延迟时间O 分钟，检测时间5分钟。3、 根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]