用于蛋白质检测的干燥分析单元制造技术

公开了一种干燥分析单元，该单元能用于灵敏快速地检测及定量分析蛋白质。使用一种染料进行化验，该染料与蛋白质及钼酸盐离子反应引起该染料光谱吸收的可测量的变化。也公开了稳定和提高化验准确度的聚合物，和减少重碳酸盐干扰的化合物。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干燥分析单元以及使用该分析单元定量分析液体样本中的蛋白质的方法。更确切地说，本专利技术涉及将特定的染料、钼酸盐离子以及含有丙烯酰胺和羟基羧酸的聚合物用于该分析单元。在医疗实践及研究、分析及诊断过程中一直需要快速准确检测各种液体、如生物体液中存在的化学及生物物质的方法。例如，在对多种人类疾病进行有效的研究、诊断和治疗时必须快速准确地测定蛋白质的有无和多少。为了进行物质检测，近几十年来人们研究了各种各样的分析方法。这些方法已非常可靠，在某些情况下，适用于自动检测，以及适用于试剂盒的形式。蛋白质化验一般在溶液中进行，或者在实验装置中进行，在该装置中液体以某种方式从参与到化验中的试剂中除去。尽管溶解工艺已为本领域广泛接受，不过通常仍然需要分析设备经常具有错综复杂的溶液处理和转运能力。而且这种化验中所用的分析设备可能涉及复杂的液体处理，也许需要技术人员来进行操作和严格的清洗，清洗是用来避免样本之间的污染。作为溶液化学的替代选择是使用干燥的分析单元。应当明确的一点是由于涂层剂的干扰，不是所有的以溶液为基础的分析化验都能适用干燥分析单元，涂层剂可以是例如粘合剂、表示活性剂、及其他提高或促进物质沉降、样本湿润、保持该分析单元结构完整所需的试剂。而且干燥分析单元必须在使用时分成小格，以分开不相容的成分。这一点与溶液化学的情况不同，后者可以将液体分开贮存、连续加入。有大量出版物描述了干燥分析单元及其用途，包括美国专利4132528号、美国专利4786605号、美国专利3992158号，Pierce等人的美国专利4258001号，Fricker等人的美国专利4670381号，WO82/2601(1982、8、5公开)、欧洲专利申请051183号(1982、5、12公开)、欧洲专利申请066648号(1982、12、15公开)。所引用的全部内容结合在此作为参考。判定和监测病人肾功能的实用指标是尿液中存在的总蛋白质浓度。依据特定的疾病状态，存在于尿液中的蛋白质性质和数量是不同的，该疾病状态导致了肾防止蛋白质通过进入尿液的功能衰竭。尿液中可能发现的蛋白质实例包括但不限于白蛋白、完整的免疫球蛋白、R游离链、λ游离链、视黄醇结合蛋白质、α-1-微球蛋白和β-1-微球蛋白。这些蛋白质的氨基酸组成和分子量大不相同。临床医师在使用尿总蛋白筛分化验时所感兴趣的信息是单位体积尿样中的蛋白质总量。诊断化验的结果，也就是理论上测得的信号，应当与可能存在的蛋白质的性质或类型无关。例如，50mg/dL白蛋白应当与50mg/dL其它蛋白质所产生的信号相同。人尿液中正常蛋白质范围约为5至100mg/dL。已有各种方法用于检测生物物质中的总蛋白浓度。在很多分析化验中都测量光学信号，如在光谱可见或紫外区的吸收，该光学信号与样本中蛋白质浓度成比例。不过该信号一般也是样本中蛋白质性质的函数，且并不仅仅与蛋白质的含量有关，这并非人们所希望的。这些方法通常依靠下列方法之一，产生可检测的光学信号1、蛋白质与Cu(Ⅱ)的配合物，缩二脲反应，引起光谱可见区可检测的但是微小的吸收。2、测量由蛋白质的芳族氨基酸产生的光谱紫外区的吸收。3、通过将特殊的氨基酸用含有发色团的分子进行衍生作用可以检测蛋白质含量，该发色团借助其特征吸收或荧光可被定量分析。4、可以使用染料检测样本中蛋白质的有无或多少，该染料能与蛋白质以非共价键方式结合生成染料-蛋白质配合物，该配合物可对染料的吸收光谱产生微扰。一些染料需要金属离子的存在，如钼或钨，在这种情况下，染料、金属离子与蛋白质的非共价配合物的生成可对染料的吸收光谱产生微扰，后者可用于检测样本中蛋白质的有无或多少。5、蛋白质与染料竞争与Cu(Ⅱ)的配位作用，产生一个与蛋白质浓度成比例的吸收信号(Cu(Ⅱ)/染料配位化合物具有与游离染料、即不与Cu(Ⅱ)配位化合物染料不同的吸收光谱)。美国专利4132528涉及基于缩二脲反应的蛋白质化验法。’528专利的干燥化验单元含有一种Cu(Ⅱ)的缩二脲试剂和一种Cu(Ⅱ)的螯合剂，如CuSO4，以及酒石酸，或二者的配合物，一种能提供PH大于12条件的缓冲系。当含水液体、如血清或脑脊髓液(CSF)中的蛋白质在PH大于12的条件下与缩二脲试剂相互作用时，发生二价形式的铜与蛋白质之间的反应产生紫色。颜色强度直接与血清蛋白质含量成比例，通过已知的比色分析技术可测得蛋白质浓度。不幸的是，该专利的干燥滑动单元敏感度比所需程度低，也就是说不能检测浓度小于等于200mg/dL的蛋白质。美国专利4786605描述了用于蛋白质定量分析的干燥分析单元的组成，它用预先生成的Cu(Ⅱ)/吡啶偶氮染料配位化合物代替缩二脲试剂，所得分析单元的灵敏度比’528专利的分析单元高。向化验单元中加入含水蛋白质后，二价铜离子被蛋白质从配合物中取代，Cu(Ⅱ)/染料配合物的吸收曲线移至未配位染料的吸收曲线。因此加入蛋白质后，Cu(Ⅱ)/染料配合物的吸收峰与蛋白质加入量成比例地降低，用含有已知浓度蛋白质的样本进行适当校正后，就能用比色法检测液体样本中未知浓度的蛋白质了。按该专利的教导，这些分析单元具有非常好的动态范围，其灵敏度也比基于缩二脲反应的分析单元高达约30倍。不过，’605专利技术在尿样蛋白质定量的用途始终表现出与作为参考标准的用考马斯蓝溶液法化验蛋白质浓度所得到的值相比，有约10至20％的尿样呈不可接受的随机阳性偏差，也就是说，某些病人尿样的预计蛋白质浓度(约占样本人群的10至20％)用’605专利技术测得的结果大于用考马斯蓝化验法测得的结果。据推断，某些尿样中的该随机阳性偏差是由还原剂的存在而引起的，如抗坏血酸，它能引发Cu(Ⅱ)与染料上可还原基团、如硝基的还原反应。人们需要一种对上述化验工艺的缺陷不敏感的干燥分析单元。溶液中在酸性条件下特定指示剂染料与蛋白质及金属离子的配位反应发生可测量的颜色变化是已知的。如上所述，溶液中奏效的分析化验方法未必很容易适合于干燥分析单元，原因已有引证。人们迫切需要的是不同的蛋白质同样与一种染料反应产生光学信号，该信号与样本中含有的蛋白质量有关，而与蛋白质的性质无关。尿中含有含量不等的碳酸氢盐(多至约200mM)。尿样中高浓度的碳酸氢盐如果不稀释或经样本预处理除去之(如分子筛分离工艺)，由于染料-金属离子-蛋白质要在低PH条件(1.5至3.5)下发生相互反应，足够多的碳酸氢盐被引入化验中产生强碱性条件，而使化验结果不可靠或毫无用处，和/或碳酸氢盐另外会干扰金属离子的配位作用。人们需要提供这样一种用于蛋白质检测的干燥分析单元，该分析单元对还原剂或碳酸氢盐的存在不敏感，该分析单元所产生的信号量度基本上与蛋白质的含量相对应，也就是说，基本上与蛋白质的性质无关(这里“基本上”指的是对于具体的蛋白质测量应用来说是适合的或可接受的，如尿样中总蛋白质的测量)，该分析单元可用于在约5至300mg/dL范围内对蛋白质进行定量分析，而无需预先稀释、预先浓缩、或进行样本预处理以除去所述干扰剂。我们意外地发现，在钼酸盐离子以及含有丙烯酰胺的聚合物、羟基羧酸化合物的存在下，可以制备得到含有指示剂染料的干燥分析单元，适用于检测生物体液中蛋白质的有无或多少。在本专利技术的干燥分析单元中，在钼酸盐离子以及丙烯酰胺聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于蛋白质检测的干燥分析单元，所述单元含有： （Ａ）一个多孔扩散层； （Ｂ）一或多个附加层，包括： （ｉ）一种染料，能与蛋白质及钼酸盐离子反应使所述染料的光谱吸收或反射强度发生变化； （ｉｉ）一种钼酸盐；和 （ｉｉｉ）一种含有丙烯酰胺的聚合物，其中所述染料、所述钼酸盐和所述含有丙烯酰胺的聚合物可以共同存在于所述单元的同一层中或者任意组合或单独存在于所述单元的各层中； （Ｃ）一层载体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T阿特，JR谢弗，DB拉塔特，RC苏顿，JC毛克，WW维贝二世，RF温特科恩，
申请(专利权)人：奥索临床诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]