对低浓度至痕量的蛋白质进行检测或定量的组合物的方法技术

一种与含有蛋白质的液态样品接触时能表现出足够的颜色的变化以指示该样品中蛋白质的存在和／或浓度的组合物，该组合物包括：铟或铟的化合物，和能与铟形成络合物的染料或色素。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于在低浓度至痕量情况下，对含有蛋白质的液态样品(如尿液)中的蛋白质进行检测或定量的组合物。判定人体往尿液中是否排泄过多的蛋白质如白蛋白等在临床上是非常重要的。即使是健康的人，即在肾脏的功能正常的情况下，也有极少量的蛋白质被排出，并且其每天的排泄总量达50到100mg。另外，已知排出的数量在身体锻炼之后或依据身体状况而增加，这被称之为生理性蛋白尿。根据电泳分析，健康人排到尿液中的蛋白质大约60％来源于血浆，而分子量约为67,000的白蛋白约占其中的70％到80％。除了生理性蛋白尿以外，可以将病理性蛋白尿分为肾前性、肾或肾后性类型，而肾类型进一步分为亚型，如源于肾小球、源于肾小管等等。肾前性蛋白尿是由于特定的器官组织功能发生变化或异常而将增加的血液蛋白质排泄至尿中造成的结果，而对这种特定的成分的检测直接与病理症状的诊断有关。典型的例子是标记癌症的Bence Jones蛋白质。在肾蛋白尿类型中，以白蛋白等为代表的肾小球蛋白尿是由于肾小球基底膜的滤过功能降低引起的，以β2-微管球蛋白和α1-微管球蛋白为代表的管蛋白是由于肾小管重吸收能力降低引起的，而这二种情况都可以作为了解肾功能降低和肾功能异常程度的良好标记。肾后性蛋白尿是表示以下症状的一种蛋白尿某种器官如肾盂、输尿管、膀胱、尿道、前列腺等处的出血、结石、肿瘤等，因而它可用于对上述的典型病症进行诊断。在众多的蛋白尿的检测方法中，使用pH指示剂四溴酚蓝(TBPB)的蛋白质误差法已具有悠久的历史并且它仍被确认为一种筛选检验的方法。TBPB在pH为2到3时显示出黄颜色，而在pH大于或等于4时显示为蓝色，但在溶液中存在蛋白质的情况下其在pH为3时显示为蓝色。如果将试纸如滤纸等浸泡在TBPB和pH为3的缓冲剂中，利用蓝色调的变化取决于尿液中蛋白质如白蛋白等的存在数量这一现象，可以根据色调的变化来读出蛋白尿的浓度。但是，一般这种“蛋白质误差法”不能检测浓度小于或等于10-15mg/dl的蛋白质。而且，由于该方法是一种试纸方法，因而这种检测是定性结果，如“-”到“±”到“+。另外，一般可检测的蛋白质只是白蛋白，而约占血浆蛋白的40％的球蛋白及上述的Bence Jones蛋白质等不能被检测出来。在这种定性测定的方法之外，还有许多已知的用于对蛋白质自身进行定量检测的方法。在Kingsbury-Clark法中例举的浊度测定法作为一种主要的常规检测方法就已沿用了大约20年，但是其缺陷在于与蛋白质误差法的情况相似，它几乎不与除了白蛋白以外的蛋白质发生反应。而且，由于这种方法是一种手工方法，检测耗时耗力。现在作为一种定量检测的方法，最为频繁使用的是如采用邻苯三酚红与金属如钼等染料络合物的染料结合法。根据这种方法，不仅可通过手工操作而且可将它用它应用于自动分析仪上而得到高度准确的测定结果。JP-B-4-53265(这里所用的术语“JP-B”意思为“受审查的日本专利出版物”)公开了一种测定痕量蛋白质的比色法，这种方法中采用了一种能与钼形成络合物并在蛋白质存在的条件下能使其波长发生偏移的染料。该方法的基本原理是已知的如果在被测定的样品中存在一种能与钼结合的物质，则该试验在正常尿液的情况下表现为负值，因而它的吸光率变得比纯水的测定值更低。为此，JP-B-4-53265采取措施将反应物中的钼掩盖于抑制剂之外，如形成与钼结合的螯合剂或形成与抑制剂结合的金属离子，如在试剂组合物中预先使柠檬酸等与钼结合。JP-B-6-70632也公开了一种测定痕量蛋白质的比色法，该方法包括采用在蛋白质存在时能与钨形成络合物并使其波长发生偏移的多羟基苯基磺酸酞染料和/或多羟基苯基酞染料，和保持组合物酸性pH的缓冲剂。此外，出版物“邻苯三酚红-钼(VI)络合物与蛋白质的颜色反应”，Y.Fujita，I.Mori和S.Kitano，分析化学，32，pp.E379-E386(1983)，描述了金属和染料的筛选试验的结果，该结果可用作利用蛋白质误差现象而进行痕量蛋白质测定的方法。该染料为多羟基苯基磺酸酞染料或多羟基苯基酞染料。被筛选的金属的实施例包括钼(VI)、钛(III)、铝(III)、铁(III)、铀(VI)、锆(IV)、锑(III)、钨(VI)、铈(III)、锡(IV)、锌(II)、镁(II)、汞(II)、银(I)和钙(II)。本专利技术的目的在于采用一种新的方法对如尿液等液态样品中的痕量蛋白质进行检测和定量。本专利技术的这一目的以及此外的目的是通过以下这种组合物实现的该组合物与含有蛋白质的液态样品接触时能表现出足够的颜色的变化以指示该样品中蛋白质的存在和/或浓度，该组合物包括铟或铟的化合物，和能与铟形成络合物的染料或色素。附图说明图1为显示采用本专利技术的组合物时，标准蛋白质溶液的连续稀释物的吸光率的测定结果的曲线图。图2为显示本专利技术组合物与先前的方法之间相关性的曲线图。图3为显示将螯合剂加入到本专利技术组合物中时的吸光率测定结果的曲线图。图4为显示在加入螯合剂时本专利技术的组合物与先前的方法之间的比较的曲线图。根据本专利技术，采用如下的指示剂试剂组合物可以在低浓度到痕量的低水平下对被测样品溶液中的蛋白质进行测定，该组合物中含有新改进的铟化合物/染料或色素络合物，因而它能获得对低浓度蛋白质的充足敏感性从而足以用肉眼判断颜色色调的变化。具体地说，可以对少量至痕量的蛋白质进行测定，可以定量地测定尿液中0mg/dl到2,000mg/dl，尤其是0mg/dl到约30mg/dl的蛋白质水平。另外，采用本专利技术的试剂组合物，可以检测和测定低浓度到痕量水平的尿液蛋白质，如浓度为0mg/dl到约30mg/dl之间，0mg/dl到约5mg/dl之间或约5mg/dl到10mg/dl之间。可以以同样的方式测定脊髓液中蛋白质的量。本专利技术的试剂组合物适于在湿条件如液态反应物下进行测定，也可在干条件下进行测定，如其中的试剂组合物被均匀地包裹在载体中。用于干条件的载体的实施例包括可吸水的多孔物质如滤纸、不吸水的物质如由渗透性聚合物制成的膜和水溶性聚合物的捏和物。该试剂组合物被包在载体内，以预定的足以使液态样品渗透至载体内的浓度均匀地充满全体。与JP-B-4-53265的情况不同的是，无需在试剂组合物中预先形成螯合剂以将铟掩盖于抑制剂之外或形成金属离子，因为与钼结合的柠檬酸等不是铟的抑制剂。本专利技术利用以下现象多羟基苯基磺酸酞染料或多羟基苯基酞染料如焦儿茶酚紫、邻苯三酚红、溴化邻苯三酚红、二甲苯酚橙、邻苯三酚酞和o-羟基对苯二酚等与铟形成络合物，如此形成的络合物与蛋白质结合而使波长发生偏移。它们可以单独或结合使用。本专利技术得到的组合物可以用作液态系统测定试剂或被加工成简单的干系统试样。对于在铟/染料或色素络合物中使用的铟化合物没有具体的限定。但是，这种铟化合物应在水中充分溶解以与上述的多羟基苯基磺酸酞染料或多羟基苯基酞染料形成络合物。另外，本专利技术中所用的铟化合物的阳离子优选为基本上不被着色，以避免具有高着色度的阳离子对测定的干扰。在水中具有充足的溶解度，并用于与多羟基苯基磺酸酞染料或多羟基酞染料形成络合物的铟化合物包括硫酸铟、氯化铟、溴化铟、硝酸铟和二硫酸铟铵(ammonium indium bissulfate)。它们可单独或结合使用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与含有蛋白质的液态样品接触时能表现出足够的颜色的变化以指示样品中蛋白质的存在和／或浓度的组合物，该组合物包含：铟或铟的化合物，和能与铟形成络合物的染料或色素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小坂秀子，
申请(专利权)人：株式会社京都第一科学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]