银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法技术

本发明专利技术属于法医学技术领域，具体涉及一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法。本发明专利技术方法是以含有钾离子适配体的新型DNA链为模板，合成具有荧光性质的DNA‑AgNCs，该体系特异性识别K+使银纳米簇荧光猝灭，根据荧光的变化绘制标准曲线，待测玻璃体液加入DNA‑AgNCs溶液中，玻璃体液中的钾离子导致银纳米簇荧光发生改变，与标准曲线相比，得出被测玻璃体液中钾离子浓度，将玻璃体样本中K+浓度与已知死亡时间绘制出标准曲线，结果与报道的死亡时间和玻璃体液钾离子关系具有良好一致性。本发明专利技术可用于法医死亡时间推断，具有高度特异性和灵敏度，操作简单、快捷，成本低廉且可应用于其它体液及水环境中钾离子含量的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于法医学
，具体涉及一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度进而推断死亡时间的方法。
技术介绍
钾离子(K+)是人体内含量最丰富的阳离子之一，对生物体具有重要的生理功能。为保持机体的正常酸碱平衡和渗透压，参与各种蛋白质及糖代谢所必需；是维持细胞新陈代谢、调节体液渗透压、维持酸碱平衡和保持细胞应激功能的重要电解质之一。其含量是机体生理活动非常重要的指标，同时血液、尿液中钾离子的含量水平可用于诊断心脏、肾脏等方面的疾病以及判断疾病的预后。此外，在法医鉴定中，由于医疗事故等时有发生；尤其电解质紊乱，心肌细胞机能与细胞膜内外一些阳离子的浓度有比较直接的关系，其中以钙离子和钾离子浓度的影响最明显。其中尤以玻璃体液中K+含量为法医学研究热点；在人体死后，玻璃体液内K+的含量呈规律性上升，与死亡时间关系极为密切，通过测量玻璃体液中K+的含量来推断人体死亡时间；同时已证实玻璃体液中K+含量受外界污染、尸体腐败以及环境因素影响很小。因此，准确测量K+含量对推断人体死亡时间具有非常重要意义。现有技术中测定K+含量的方法主要有：化学测定法、同位素质谱法、火焰光度法、原子分光光度法、酶法以及离子选择电极法等。其中常规检测方法是离子选择电极法和火焰光度法。(1)火焰光度法：该方法利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，是一种发射光谱分析法，可检测玻璃体液、尿液、血清、脑脊液中的K+含量。常见的定量方法包括内标法和外标法，其中外标法一般操作误差较大，并不常用；内标法将标准液和标本中加入相同浓度的内部标准进行测定，通常加入锂内标，随后测定锂/钾电流比值，而不是单独测量钾离子的电流，这样便可减少误差，提高测量的准确性。其缺点在于，火焰光度法在检测过程中，灵敏度受燃气压力、助燃气的压力、标本进样速度影响，标本加入蒸馏水后要充分混匀，否则分析的样本与实际值有一定偏差。此外，火焰光度法最大不足在于所使用的是丙烷等燃气，给实验室带来安全隐患。(2)化学测定法：主要利用离子载体复环王冠化合物进行测定，由于环内部有大小不一的空腔结构，其内部氧原子电子对可与金属离子螯合。不同大小的空腔可选择性结合不同直径的金属离子，从而测量离子浓度。但是阴离子、溶剂、王冠化合物浓度、液膜厚度和温度等因素对金属离子在化合物中的迁移速率影响较大，容易导致测量结果不准确。(3)离子选择电极法：在专用仪器上进行尿液、血液、水中钾离子测定。其原理为：离子选择性电极是一类化学传感器，在一定范围内，其电位与溶液中所给定的离子活度的对数呈直线关系，可利用该线性关系测定液体试样，溶液的颜色和浑浊度一般不会对测量结果有影响。该方法又分为直接测定和间接测定法，目前常采用后者测定。由于间接测定法将待测物稀释后测定，所得离子活度更接近离子浓度。主要采用的电极有：固相电极、液态膜电极、玻璃膜电极等。但这些电极会随使用时间而老化，价格较贵。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法，目的是通过基于DNA链合成的DNA-AgNCs荧光探针测定钾离子浓度，使得钾离子测定更简便、更快速、更准确。本专利技术提供的银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法，按照以下步骤进行：(1)制备荧光DNA-AgNCs：首先设计含有钾离子适配体且可装载AgNCs的DNA链，在DNA链中加入AgNO3溶液，振荡后加入NaHB4溶液，再次振荡后放入冰箱3小时，得棕黄色液体，即荧光DNA-AgNCs；(2)制备钾离子浓度与荧光强度标准曲线：配制不同浓度钾盐溶液，将其加入至步骤(1)的荧光DNA-AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，得到钾离子浓度与荧光强度的标准曲线；(3)实际玻璃体液样本钾离子浓度检测：将已知死亡时间的待测玻璃体液加入至步骤(1)的荧光DNA-AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，根据制备步骤(2)的钾离子浓度与荧光强度标准曲线得出所测样本中K+浓度；(4)制备钾离子浓度与死亡时间标准曲线：根据步骤(3)中所测得已知死亡时间的玻璃体液K+浓度与已知样本的死亡时间，绘制线性关系图，制得钾离子浓度与死亡时间的标准曲线；(5)死亡时间推断：测定未知死亡时间的待测玻璃体液K+浓度，根据步骤(4)的钾离子浓度与死亡时间标准曲线，从而推断出所测样本的死亡时间。其中，所述的含有钾离子适配体且可装载AgNCs的DNA链是能够形成G-四聚体的DNA链，选自核苷酸序列表IDNO.1、核苷酸序列表IDNO.2、核苷酸序列表IDNO.3、核苷酸序列表IDNO.4、核苷酸序列表IDNO.5、核苷酸序列表IDNO.6、核苷酸序列表IDNO.7、核苷酸序列表IDNO.8、核苷酸序列表IDNO.9、核苷酸序列表IDNO.10、核苷酸序列表IDNO.11、核苷酸序列表IDNO.12、核苷酸序列表IDNO.13所示DNA序列。。所述的DNA链与AgNO3、NaHB4摩尔浓度比为1:2～10:2～10，优选1:6:6。所述荧光AgNCs溶液的pH值为6-7.5。所述钾盐包括氯化钾、硝酸钾和溴化钾及其它含钾化合物。所述待测溶液为人或动物的玻璃体液、血液、尿液或其他液体。所述的步骤(2)和步骤(3)的反应时间为0.1～4小时。所述利用银纳米簇检测液体中钾离子浓度在法医鉴定用来准确推测死亡时间。所述方法用于检测玻璃体液中其他成分，包括ATP、次黄嘌呤、镁离子。与现有技术相比，本专利技术的特点和有益效果是：本专利技术的银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法的基本原理是基于DNA链合成DNA-AgNCs荧光探针测定钾离子浓度，即利用DNA单体中的N原子与Ag形成较强的配位键，通过氨基特异性连接DNA-AgNCs后发出强荧光，本专利技术中是将AgNO3、NaHB4按一定比例通过化学键偶联于目标DNA上，物理降温后得到荧光DNA-AgNCs，随后该荧光纳米族再次特异性的螯合K+使其荧光猝灭，根据荧光的变化可测定K+浓度。将待测钾离子溶液滴在上述荧光DNA-AgNCs溶液中，检测其荧光变化，通过与所制得的标准曲线相比较，得出被测体液的钾离子水平。本专利技术的优点是：(1)本专利技术利用DNA链特异性识别并结合K+，形成调控的G-四聚体构象，可不受其他离子的影响，对钾离子具有极高的特异性。(2)本专利技术使用DNA-AgNCs作为荧光探针，对K+调控的G-四聚体构象非常敏感，具有较高的灵敏度。(3)本专利技术设计的基于DNA链的DNA-AgNCs荧光探针，只需荧光光谱仪，成本较低，可广泛推广。(4)本专利技术的用于K+检测的基于DNA链的DNA-AgNCs荧光探针制备过程要求的条件易控制，操作简洁，低能耗，为清洁生产工艺，可进行批量生产。(5)本专利技术的用于K+检测的基于DNA链的DNA-AgNCs荧光探针，所用试剂均为普通的化学试剂安全无毒，环保无污染，能够广泛应用。(6)本专利技术所用试剂种类较少，简单操作、快捷且成本低廉；物质稳定性好，可长时间储存，可保证测定效果。(7)本专利技术所提供的钾离子测定方法不仅可以测定人体、动物体内血液、尿液、玻璃体液等体液中的K+浓度，还可以对水质等其他样品中的钾离子浓度进行测定，应用广泛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)制备荧光DNA‑AgNCs：首先设计含有钾离子适配体且可装载AgNCs的DNA链，在DNA链中加入AgNO3溶液，振荡后加入NaHB4溶液，再次振荡后放入冰箱3小时，得棕黄色液体，即荧光DNA‑AgNCs；(2)制备钾离子浓度与荧光强度标准曲线：配制不同浓度钾盐溶液，将其加入至步骤(1)的荧光DNA‑AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，得到钾离子浓度与荧光强度的标准曲线；(3)实际玻璃体液样本钾离子浓度检测：将已知死亡时间的待测玻璃体液加入至步骤(1)的荧光DNA‑AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，根据制备步骤(2)的钾离子浓度与荧光强度标准曲线得出所测样本中K+浓度；(4)制备钾离子浓度与死亡时间标准曲线：根据步骤(3)中所测得已知死亡时间的玻璃体液K+浓度与已知样本的死亡时间，绘制线性关系图，制得钾离子浓度与死亡时间的标准曲线；(5)死亡时间推断：测定未知死亡时间的待测玻璃体液K+浓度，根据步骤(4)的钾离子浓度与死亡时间标准曲线，从而推断出所测样本的死亡时间。...

【技术特征摘要】
1.一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)制备荧光DNA-AgNCs：首先设计含有钾离子适配体且可装载AgNCs的DNA链，在DNA链中加入AgNO3溶液，振荡后加入NaHB4溶液，再次振荡后放入冰箱3小时，得棕黄色液体，即荧光DNA-AgNCs；(2)制备钾离子浓度与荧光强度标准曲线：配制不同浓度钾盐溶液，将其加入至步骤(1)的荧光DNA-AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，得到钾离子浓度与荧光强度的标准曲线；(3)实际玻璃体液样本钾离子浓度检测：将已知死亡时间的待测玻璃体液加入至步骤(1)的荧光DNA-AgNCs溶液中，反应一段时间后测量其在630nm处的荧光强度，根据制备步骤(2)的钾离子浓度与荧光强度标准曲线得出所测样本中K+浓度；(4)制备钾离子浓度与死亡时间标准曲线：根据步骤(3)中所测得已知死亡时间的玻璃体液K+浓度与已知样本的死亡时间，绘制线性关系图，制得钾离子浓度与死亡时间的标准曲线；(5)死亡时间推断：测定未知死亡时间的待测玻璃体液K+浓度，根据步骤(4)的钾离子浓度与死亡时间标准曲线，从而推断出所测样本的死亡时间。2.根据权利要求1所述的一种银纳米簇检测玻璃体液中钾离子浓度推断死亡时间的方法，其特征在于，所述的含有钾离子适配体且可装载AgNCs的DNA链是能够形成G-四聚体的DNA链，选自核苷酸序列表IDNO.1、核苷酸序列表IDNO.2、核苷酸序列表IDNO.3、核苷酸序列表IDNO.4、核苷酸序列表...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁艳君，凌江，李杏梅，蔡继峰，郭亚东，扎拉嘎白乙拉，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43