用于肝细胞癌诊断的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于肝细胞癌筛选、诊断、预后、和用于监测肝细胞癌治疗效果和药物开发的方法和组合物。描述了可以使用双向电泳分析血清或血浆来测定的肝细胞癌诊断特征（ＨＦ）。本发明专利技术进一步提供了在血清或血浆中可检出的肝细胞癌诊断蛋白质同种型（ＨＰＩ）、包含已分离的ＨＰＩ的制剂、针对ＨＰＩ的免疫特异性抗体，以及包含前述的试剂盒。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1．简介本专利技术涉及与肝细胞癌(hepatoma)相关的蛋白质和蛋白质同种型(isoform)的鉴定，以及它们在筛选、诊断、预后、治疗和药物开发方面的用途。2．专利技术背景肝细胞癌是一种发病率不断上升的癌症，世界范围内有几十万患者。此病的治疗方法还相对缺乏，获得更有效治疗的主要希望在于能够更早和更准确的诊断。血清甲胎蛋白(AFP)的测定广泛应用于肝细胞癌的诊断。当AFP水平显著上升时，它是一个有用的标志物，但是当AFP在较低水平时，它对于肝细胞癌很差的特异性和阳性检出率(PPV)严重的限制了其临床应用。Johnson等人，1997，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，75236-240。某些凝集素与肝细胞癌血清中的AFP的结合显示出不同于与良性状况下的AFP的结合。Aoyagi等人，1985，生物化学生物物理通报(Biochim.Biophys.Acta)，830217-223；Aoyagi等人，1993，英国癌症杂志，67486-492。但是这些研究还未被临床广泛的接受。Johnson等人，同上。最近，等电聚焦已经用于AFP同种型的检查，这些同种型表现出对肝细胞癌相对特异性。Johnson等人，同上。这些报道说明在肝细胞癌的诊断中越来越需要鉴定血清中的标志物。3．专利技术概述本专利技术提供了用于肝细胞癌的筛选、诊断和预后、用于监测肝细胞癌治疗有效性和用于药物开发的方法和组合物。专利技术的第一方面提供了用于肝细胞癌诊断的方法，包括通过双向电(two-dimentional electrophoresis)对血浆或血清样品进行分析，以检测至少一种肝细胞癌诊断特征(HF)的水平，例如选自此处所公开的HF中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。专利技术的第二方面提供了用于肝细胞癌诊断的方法，包括检测血浆或血清样品中至少一种肝细胞癌诊断蛋白质同种型(HPI)的水平，例如选自此处所公开的HPI组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。专利技术的第三方面是提供了能够与一种HPI，例如此处公开的一种HPI，免疫特异性结合的单克隆和多克隆抗体专利技术的第四方面是提供了一种制品，该制品包含一种已分离的HPI，即一种不含与HPI有明显不同表观分子量或等电点的蛋白质或蛋白质同种型的HPI。4．附图简述附图说明图1是由正常人血清的双向电泳得到的图像，图像显示鉴定出了14个界点特征，标记为PL1-PL12和PL15-PL16。5．专利技术详述以下详细叙述的专利技术包括用于哺乳动物受试者中肝细胞癌筛选、诊断、预后的方法和组合物，以及用于肝细胞癌治疗效果监测的方法和用于药物开发的方法。优选地，受试者是人，更优选地，受试者是成年人。为了公开清楚而不以任何方式限制，本专利技术将以血清样品的分析为例进行描述。但是，作为一个本领域的技术人员应当理解，此处所述的鉴定和技术可以应用于其它类型的病人样品，包括体液(例如血浆、尿液、胆汁、腹水)、怀疑含有来源于肝细胞癌物质的组织样品(例如肝脏活检或可疑肿块活检的活检样品)或其匀浆。5．1．肝细胞癌诊断特征(HF)在本专利技术的一个方面中，双向电泳用于分析受试者血清以测量一个或多个肝细胞癌诊断特征(HF)的丰度，可用于肝细胞癌的筛选和诊断、决定肝细胞癌患者的预后、监测肝细胞癌治疗的效果或者用于药物的开发。此处所用的双向电泳是指一项包括等电聚焦和随后的变性电泳在内的技术。它可以产生包含多个已分离的蛋白质的双向胶(2D-gel)。优选地，，变性电泳步骤使用十二烷基磺酸钠存在下的聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。特别优选的是美国申请第08/980，574和WO 98/23950中所描述的高度准确和自动化的方法及设备(“优选技术”)，此处完整引述作为参考。简要的说，优选的技术提供了足够的、计算机辅助的方法和设备以用于生物样品中生物分子的鉴定、选择和特征描述。根据生物分子的电泳迁移率和等电点在双向胶中分离它们，可以得到一个双向图谱(array)。由此图谱可以产生一个计算机形成的数字图形，代表双向图谱中检测的多种生物分子的特性、表观分子量、等电点和相对丰度，因而能够允许将来自多个生物样品的图形进行计算机辅助的比较，以及计算机辅助的已分离目标蛋白质的切割。此处所用的术语“肝细胞瘤诊断特征(HF)”指的是在生物样品经双向电泳后可检出的特征(例如双向胶中的一个点)，它以不同的方式表现在一个样品和另外的与其相关样品中，例如在一个患有肝细胞癌的受试者血清中与在一个没有患有肝细胞癌的受试者血清中。当用于检测特征(或蛋白质同种型)的方法(例如双向电泳或免疫分析方法)显示所检测特征(或蛋白质同种型)在第一个样品中与在第二个样品中的相对丰度不同时，则此处所用的术语特征(或蛋白质同种型)相对于第二个样品而言，“不同的存在于”第一个样品中。如果所测量的特征在第一个样品中的丰度高于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“升高”的；相反的，如果所测量的特征在第一个样品中的丰度低于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“降低”的。优选的，特征在两个样品中的相对丰度是通过两个步骤来确定的。首先，参照一个适当的背景参数将依赖于样品中所发现特征而得到的信号进行标准化，例如，参照分析样品中的总蛋白质(例如上样到胶上的总蛋白质)，参照一个稳定的特征，也就是已知的在所比较的样品中含量相似的一个特征，例如一个或多个“表达参考特征”(ERF)，例如下面公开的“表达参考特征”，或者参照来源于样品中所有蛋白质的能检测到的总信号。其次，一个或一组样品中已标准化的特征的信号与另外一个或一组样品中同一特征的已标准化的信号相比较，用以鉴定那些相对于第二个样品(或样品组)“不同的存在于”第一个样品(或样品组)中的特征。通过优选技术部分中的方法和设备，已鉴定出两组HF。第一组包括相对于无肝细胞癌受试者血清(例如患有肝硬化的受试者)在患有肝细胞癌的受试者血清中降低的HF。这些HF可以用表观分子量(MW)和等电点(PI)表述如下表Ⅰ在肝细胞癌血清中降低的HF 第二组包括相对于无肝细胞癌受试者血清(例如，患有肝硬化的受试者)在患有肝细胞癌的受试者血清中升高的HF。这些HF可以用表观分子量(MW)和等电点(PI)表述如下表Ⅱ在肝细胞癌血清中升高的HF 表Ⅱ(续) 对于任何指定的HF来说，将分析患有肝细胞癌的受试者血清时观察到的标准化信号与相对于分析无肝细胞癌的受试者血清时观察到的标准化信号加以比较，所得到的比率依赖于所用的特定分析规程和检测技术。因而，本专利技术构思了作为诊断领域的传统做法，每一个实验室应当根据所使用的分析规程和检测技术建立针对无肝细胞癌受试者血清中每一个HF的参考范围。优选的，分析测试样品时每一批次中应当包括至少一个来自已知患有肝细胞癌的受试者的阳性对照血清样品，和至少一个来自已知无肝细胞癌的受试者的阴性对照血清样品(更优选的是至少一个阳性和至少一个阴性对照样品)。作为熟练的技术人员应当容易理解，一个给定特征或蛋白质同种型的测量分子量和等电点会根据双向电泳和区带匹配的每一步骤所用的具体规程而在一定范围内变动。此处所用的术语“分子量”和“等电点”分别定义为准确依照在下文第六节列出的实验规本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人类受试者中肝细胞癌的筛选、诊断或预后，或者用于监测向人类受试者施用的抗肝细胞癌药物或治疗的效果的方法，包括：（ａ）用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；（ｂ）对于强度与肝细胞癌的存在与否相关的至少两个所 选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的强度与在一个或多个无肝细胞癌的受试者血清或血浆中所选特征的强度相比较，其中，样品中所选特征的强度表明受试者存在或不存在肝细胞癌。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RB帕尔克，TP帕特尔，RR唐森德，C莫伊赛斯，PJ约翰逊，
申请(专利权)人：牛津糖科学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]