本发明专利技术涉及一种癌症诊断技术，特别是血清ＩＬ－６在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒制备中的应用。该试剂盒可以快速、准确地进行ＩＬ－６的检测，从而可以对各期（特别是早期）原发性肝细胞癌作出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。本发明专利技术包括建立了基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度大大提高。本发明专利技术有益的积极效果是：检测试剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
血清IL-6在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒中的应用本专利技术涉及一种癌症诊断技术，特别是原发性肝细胞癌诊断试剂盒的制备。 肝癌是人类最常见恶性肿瘤之一，其发病率在全世界范围内位居第五，而且在肿瘤致死率中位于第三。每年约新增500000病例，经年龄修正后的发病比率为5. 5-14. 9/10万人。 肝细胞肝癌(H印atocellular carcinoma, HCC)是原发性肝脏恶性肿瘤中的最主要类型， 高发区域主要集中在东亚，东南亚，中西非等地区。从1990年开始，HCC在中国的肿瘤致 死原因中高居第二，乙肝病毒、丙肝病毒感染，黄曲霉素B1的摄入和酗酒等被认为是主要 的风险因子。肝细胞肝癌性肿瘤，也是中国华南地区常见恶性肿瘤之一，寻找HCC的早期 血清学诊断标志物，对于肝癌的预防和早期治疗均具有重要意义。长期以来，AFP作为原 发性肝癌的诊断指标，为临床作出了重大的贡献。但是，AFP的敏感性是有限的；特别是 近年来，AFP阴性的HCC患者有上升趋势，因此，寻找AFP之外的肿瘤早期标志物是当务 之急。白细胞介素-6 (Interleukin-6， IL-6)是一种促炎症细胞因子，在宿主防疫机制中发 挥重要作用。在正常生理状态时，IL-6的水平比较低；但是在创伤、炎症、肿瘤等各种病 理情况下，IL-6的表达明显升高。专利技术人通过检测正常人、乙肝病毒携带者和HCC患者血清中IL-6的含量，通过统计学分析，根据IL-6含量与HCC的相关性，希望为HCC的临床血清学早期诊断找到新的生物标 记物。本专利技术公开了一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒可以快 速、准确地进行IL-6的检测，从而可以对各期(特别是早期)原发性肝细胞癌作出快速的 辅助诊断，具有歪要的临床应用价值。本专利技术包括建立了基于双抗体夹心原理的酶联免疫 诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度大大提高。本专利技术有益的积极效果是检测试 剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广 应用，具有广阔的市场前景。,图l:正常人、HBV携带者、原发性肝细胞癌(HCC)患者血清IL-6浓度直方图。 图2:正常人、HBV急性感染者、HBV慢性感染者、小肝癌、中等大小肝癌及大肝癌患者血清IL-6浓度直方图。图3:正常人、HBV急性感染者、HBV慢性感染者、AFP阴性肝癌患者及AFP>25pg/L肝癌患者血清IL-6浓度直方图。 材料取血清样品，包括30份经临床实验室检测没有感染HBV、 HCV、 HIV，并没有肿瘤的正 常体检人群血清样品；50份HBV携带者血清，其中大三阳患者22名，小三阳患者28名； 84份原发性肝细胞癌患者血清样品，其中包括39份小肝癌(直径〈5cm)， 27份中等大小 肝癌(5《直径《10cm)， 18份大肝癌(直径〉10cm)。并且，在全部检测的HCC样品中， AFP《25l^g/L占33份，AFP>25^g/L占51份。试剂盒内设有1、包被在固相96孔酶标板上的人IL-6重组单克隆抗体；2、酶结合物 工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记的人]:L-6重组单克隆抗体反应液；3、阳性对照为人 :[L-6标准蛋白，阴性对照为标准阴性血清；4、显色液ABTS底物ABTS lmg + 0. 1M， pH5.0 柠檬酸缓冲液2ml+3% H2024 u l(临用时配)；5、洗涤液(0. 05%TVeen20-PBS) ; 6、结合 物稀释液0. 1XBSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)以及7、终止液(1 2MH2S04)。方法1. 包被包被缓冲液(0. 05M，pH9.6 Na2C0 3-NaHC0 3缓冲液)稀释IL-6单克隆 抗体粗提蛋白至lPg/ml,加入96孔板，100y 1/孔，放4。C，36小时。2. 封闭洗涤液冲洗96孔板5次，加结合物稀释液200ul/孔，放37'C，2小时。3. 加待检样品洗涤液冲洗96孔板5次，加待检样品及结合物稀释液稀释的标准品 100u 1/孔，放37'C,2小时。4. 加酶标抗体洗涤液冲洗96孔板5次，结合物稀释液稀释酶标抗体至1 : 800， 加入96孔板，100yl/孔，放37。C，2小时。5. 显色洗涤液冲洗96孔板5次，显色液ABTS底物，加入96孔板，100ul/孔， 加终止液室温下或37。C显色15 30分钟。6. 标准曲线根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上査出待检标本的含量。7. 数据统计所有的统计均使用SPSS 13. 0软件包((Stat isticat Package for the Social Sciences, Chicago, IL， USA)。数据采用均值土S表示；所有尸值均取两位小数，尸 <0. 05被认为具有统计学意义，尸<0. 01被认为具有显著意义。结果和讨论原发性肝细胞癌是一个在东亚和南亚地区高发的恶性肿瘤，每年大概有25万到100万人会得肝癌，每年因为肝癌而死亡的人口在20万左右。造成肝癌发病的原因很复杂，从环 境影响和生活习惯角度说，摄入了黄曲霉污染的食物、酗酒、以及乙型、丙型肝炎的感染等 等都会提高肝癌发生的可能性。研究发现，在HIV、呼吸道合胞病毒、仙台病毒、HBV感染者等多种病毒感染者及肺癌、 口腔癌、结直肠癌等肿瘤患者血清中IL-6的水平升高。较高水平的IL-6也反应了机体对内 毒素的高度敏感性。研究发现，HBV携带者血清中IL-6的水平虽然比正常对照组有轻微的升高，但是没有统 计学意义(p〉0.05);而HCC患者平均的IL-6水平明显高于正常对照组(/X0.01)和HBV携带 者(;XO. 01)，其中小肝癌与正常对照组(;X0.05)及HBV组(;X0.05)也有统计学意义，提 示HCC患者细胞大量分泌IL-6。此外，我们发现AFP《25Pg/L及AFP〉25^g/L与正常对照组 (p〈0.01)和HBV组(p〈0.01)比较，均有显著统计学意义，提示我们，在AFP阴性HCC患者中， IL-6也许是一个较好的检测指标。由于肝细胞癌具有较高的异质性，同时检测2种或以上的肿瘤生物标记物被认为是肿瘤 早期诊断的较好选择。我们的结果清楚表明，IL-6可以作为HCC的早期血清学诊断生物标志 物，特别是当IL-6与经典标志物AFP相结合检测原发性肝细胞癌时，大大提高了HCC的早 期诊断率，弥补了单纯检测AFP的不足。不仅如此，由于IL-6和AFP都与原发性肝细胞癌 有高度相关性，这就使得两者联合检测，对原发性肝细胞癌具有早期诊断意义。表l:正常人、HBV急性感染及携带者及原发性肝细胞癌患者血清中IL-6浓度及其统计学意义<table>table see original document page 6</column></row><table>其中，小肝癌患者正常人(或HBV携带者)*p<0.05中等大小或者大肝癌患者正常人(或HBV携带者)'p〈0.01表2: AFP相关的原发性肝细胞癌患者中血清IL-6浓度与正常人和HBV感染者的统计学比较NormalHBVHBVHCC HCC急性 慢性AFP=25ng/L 本文档来自技高网...
【技术保护点】
血清ＩＬ－６在制备原发性肝细胞癌诊断试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥复，谢丹，朱萧，陈敏山，李东培，王毅，廖奕佶，童铸廷，李奎，林李家宓，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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