用于类风湿性关节炎诊断的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于类风湿性关节炎之筛选、诊断、预后、和用于监测类风湿性关节炎治疗效果和药物开发的方法和组合物。描述了可以使用双向电泳分析血清或血浆来测定的类风湿性关节炎诊断特征（ＲＡＤＦ）。本发明专利技术进一步提供了在滑液、血清或血浆中可检出的类风湿性关节炎诊断蛋白质同种型（ＲＰＩ）、包含已分离的ＲＰＩ的制剂、针对ＲＰＩ的免疫特异性抗体，以及包含前述的试剂盒。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1．导言本专利技术涉及与类风湿性关节炎相关的蛋白质和蛋白质同种型(isoform)的鉴定，以及它们在筛选、诊断、预后、治疗和药物开发方面的用途。2．专利技术背景类风湿性关节炎(RA)是一种多系统性疾病，其中免疫异常特征性地导致对称性关节炎症、关节磨损和关节外并发症。这是最为常见的和致残性自身免疫关节炎，且已充分定义了遗传易感性。它大约影响1-3％的人口。随着年龄的增加发病率增加，在30-55岁之间发病率最高。类风湿因子，即针对免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的抗体存在于75％的RA患者中。类风温因子可为IgM、IgG或IgA。据信，天然存在的类风湿因子在机体异源抗原的清除中起重要作用。在类风湿性关节炎中，各种类风湿因子由滑膜浆细胞产生，其具有形成免疫复合物、活化补体以及参与炎性反应的能力，提示其参与类风湿性关节炎的发病。RA中类风湿因子与IG半乳糖基化降低共存，是严重疾病的指征。滑膜组织是RA中炎症的主要靶点，存在CD4+T淋巴细胞、活化的B-淋巴细胞、单核细胞及多形核淋巴细胞的慢性滑膜浸润。HLA Ⅱ型表达的增加且几乎可见于所有细胞类型，表明它们处于活性状态。慢性疾病的特征在于软骨及骨的磨损，以及滑膜过度生长。RA诊断一直困难。不能由病史、检查及早期疾病的研究得出疾病模式。目前没有用于RA的诊断性试验，美国风湿病学学院定义了RA分类的标准(Medicine(编)Axford,J.,Blackwell Science,1996,3.18-3.22)。这些标准仅仅是观察性标志，这些标志的综合可视为RA的指征。患有RA的成年人中75％呈IgM类风湿因子阳性。在疾病早期可能不存在这种现象。在诊断中可使用类风湿因子的水平进行预后，但其波动无助于疾病的监测。在30％患者中存在抗核抗体。通常使用凝集试验测量IgM类风温因子。这包括胶乳试验(其中用IgG包被的颗粒凝集)以及绵羊-细胞凝集试验(SCAT或瓦-罗试验)，其中绵羊红细胞凝集。至少有70％的通过其他标准诊断为RA患者的类风湿因子胶乳凝集试验呈阳性。在其他风湿性疾病、病毒性感染、慢性炎性疾病、肿瘤或化疗中，类风湿因子也呈阳性，且明显地在4％健康个体中也呈阳性。RA的药物治疗致力于(1)缓解疼痛(止痛)；(2)一旦炎性事件被引发即对其加以纠正(抗炎症药)；以及(3)纠正导致炎症的免疫学事件(疾病纠正药物)。3．专利技术概述本专利技术提供了用于类风湿性关节炎的筛选、诊断和预后、用于监测类风湿性关节炎治疗有效性和用于药物开发的方法和组合物。专利技术的第一方面提供了用于类风温性关节炎诊断的方法，包括通过双向电泳(two-dimentional electrophoresis)对样品(如血浆、血清或滑液)进行分析，以检测至少一种类风湿性关节炎诊断特征(RADF)的水平，例如选自此处所公开的RADF组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。专利技术的第二方面提供了用于类风湿性关节炎诊断的方法，包括检测样品(如血浆、血清或滑液)中至少一种类风湿性关节炎诊断蛋白同种型(RPI)的水平，例如选自此处所公开的RPI组中的一种。这些方法也适用于筛选、预后、监测治疗效果和药物开发。专利技术的第三方面是提供了能够与一种RPI，例如此处公开的一种RPI，免疫特异性结合的单克隆抗体和多克隆抗体专利技术的第四方面是提供了一种制品，该制品包含一种已分离的RPI，即一种不合与RPI有明显不同表观分子量或等电点的蛋白质或蛋白质同种型的RPI。专利技术的第五方面提供了用于治疗或防止类风湿性关节炎的方法，包括施用能降低至少一种RADF水平(或者至少一种RPI的水平或活性)的化合物，与RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以增高的水平存在。优选地，施用的化合物为抗体、反义寡核苷酸、核酶或能够形成三螺旋的寡核苷酸。专利技术的第六方面提供了用于治疗或防止类风湿性关节炎的方法，包括施用能增高至少一种RADF水平(或者至少一种RPI的水平或活性)的化合物，与RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以降低的水平存在。优选地，施用的化合物为RPI、编码RPI的核酸(如，作为一种表达载体的一部分的核酸)或能够表达且分泌一种或多种RPI的细胞。4．附图简述附图说明图1是由正常人血清的双向电泳得到的图像，图像显示鉴定出了14个界点特征，标记为PL1-PL16。5．专利技术详述以下详细叙述的专利技术包括用于受试者中类风湿性关节炎筛选、诊断、预后的方法和组合物，以及用于类风湿性关节炎治疗效果监测的方法和用于药物开发的方法以及用于治疗类风湿性关节炎的方法。优选地，受试者是哺乳动物，更优选为人，最优选地，受试者是成年人。为了公开清楚而不以任何方式限制，本专利技术将以血清及滑液样品的分析为例进行描述。但是，作为一个本领域的技术人员应当理解，此处所述的鉴定和技术可以应用于其它类型的病人样品，包括体液(例如血浆、尿液、脑脊液、关节吸出物)、组织样品或其匀浆。5.1．类风湿性关节炎诊断特征(RADF)在本专利技术的一个方面中，双向电泳用于分析受试者血清以测量一个或多个类风湿性关节炎诊断特征(RADF)的丰度，可用于类风湿性关节炎的筛选和诊断、决定类风湿性关节炎患者的预后、监测类风湿性关节炎治疗的效果或者用于药物的开发。此处所用的双向电泳是指一项包括等电聚焦和随后的变性电泳在内的技术。它可以产生包含多个已分离的蛋白质的双向胶(2D-gel)。优选地，变性电泳步骤使用十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。特别优选的是美国申请第08/980,574和WO 98/23950中所描述的高度准确和自动化的方法及设备(“优选技术”)，此处完整引述作为参考。简要的说，优选的技术提供了足够的、计算机辅助的方法和设备以用于生物样品中生物分子的鉴定、选择和特征描述。根据生物分子的电泳迁移率和等电点在双向胶中分离它们，可以得到一个双向图谱(array)。由此图谱可以产生一个计算机形成的数字图形，代表双向图谱中检测的多种生物分子的特性、表观分子量、等电点和相对丰度，因而能够允许将来自多个生物样品的图形进行计算机辅助的比较，以及计算机辅助的已分离目标蛋白质的切割。此处所用的术语“类风湿关节炎诊断特征(RADF)”指的是在生物样品经双向电泳后可检出的特征(例如双向胶中的一个点)，它不同地存在于一个样品和另外的与其相关样品中，例如(1)在一个患有类风湿性关节炎的受试者血清中与在一个没有患有类风湿性关节炎的受试者血清中相比；或者(2)在一个取自患有类风湿性关节炎的受试者滑液中与在一个取自未患有类风湿性关节炎的受试者血清中相比。如此处所用，当用于检测特征(或同种型)的方法(例如双向电泳或免疫分析方法)显示所检测特征(或蛋白质同种型)在第一个样品中与在第二个样品中的相对丰度不同时，则此处所用的术语特征(或蛋白质同种型)相对于第二个样品而言，“不同地存在于”第一个样品中。如果所测量的特征在第一个样品中的丰度高于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“升高”的；相反的，如果所测量的特征在第一个样品中的丰度低于在第二个样品中的量，则相对于第二个样品，特征或同种型在第一个样品中是“降低”的。优选的，特征在两个样品中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于受试者中类风湿性关节炎的筛选、诊断或预后的方法，或者用于监测向受试者施用的抗类风湿性关节炎药物或治疗的效果的方法，包括：（ａ）用双向电泳分析受试者血清或血浆样品，以产生特征的双向图谱；（ｂ）对于其相对丰度与类风湿性关节炎的存 在与否相关的至少一个所选特征，将所选特征中的每一个特征在样品中的丰度与在一个或多个无类风湿性关节炎的受试者血清或血浆中所选特征的丰度相比较，其中，样品中所选一个或多个特征的相对丰度表明受试者中存在或不存在类风湿性关节炎。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RB佩雷克，TP帕泰尔，RR汤森，
申请(专利权)人：牛津糖科学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]