检测乙型肝炎病毒е抗原的试剂盒及用途制造技术

本发明专利技术检测乙型肝炎病毒ｅ抗原的试剂盒及用途涉及病毒免疫学检测技术领域。本发明专利技术所要解决的技术问题是提供检测乙型肝炎病毒ｅ抗原的试剂盒及用途以解决现有技术中存在的包被单抗、酶标多抗ＥＬＩＳＡ检测ＨＢｅＡｇ的假阳性率高、敏感性低等技术缺陷并公开其在检测ＨＢｅＡｇ中的应用。本发明专利技术公开了检测乙型肝炎病毒ｅ抗原的试剂盒，其特征在于包括包装于容器中的识别乙型肝炎病毒ｅ抗原不同表位的单克隆抗体，任选地其中一种抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。本发明专利技术的试剂盒在临床上用于检测乙型肝炎病毒，特异性高，灵敏度可达ｎｇ级，ＨＢｅＡｇ的浓度在３ｎｇ／ｍｌ－９５ｎｇ／ｍｌ范围内具有很好的线性关系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒免疫学检测
，具体涉及检测乙型肝炎病毒e抗原的试剂盒及其用途。
技术介绍
近年来，肝病已经越来越成为威胁人类健康的主要疾病之一，其中病毒性肝炎中尤以乙型肝炎对人类影响最大。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性公共健康问题，成为了当前的一种世界性疾病。目前全世界HBV持续感染者达3.5亿，其中75％在亚洲和西太平洋地区。我国是乙型肝炎的高流行区，HBV感染者达1.2亿，平均年发病约140万左右，居法定传染病第三位。随着我国对乙型肝炎的深入了解，自我保健意识的逐步加强，对乙肝的预防与检测成为了医疗界的重要课题。由于乙肝影响范围的广泛性、危害的严重性，乙型肝炎诊断试剂作为专用于乙肝患者各种生理指标的检测、乙肝的诊断和治疗过程监测的生物学和化学试剂，具有广泛的应用范围和社会需求。无论是新产品的开发还是已有产品的市场推广，均具有巨大潜力。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒相关的一个分泌型的抗原，在前C区编码，和核心抗原(C抗原)有部分同源性，但是由于在N端有了一个信号肽，所以是一个分泌型的抗原。HBeAg与HBV DNA、DNAP和前-S高度相关，共同代表病毒复制(Matsuo M.，Clinical Evaluation or HBeAg/Anti-Hbesystem in HBeAg Positive Hapatitis，Acta Hepatol Spn.，1985，26(7)819)。目前在乙型肝炎病毒的血清标志物中HBeAg是应用最为广泛、最为可靠的评估乙型肝炎病毒(HBV)复制与传染性的指标之一。HBeAg阳性有助于判断急性肝炎的预后、代表血液传染性强，亦可作为抗病毒药物疗效的考核指标之一(彭文伟主编，《病毒性肝炎研究》，广东科技出版社，1998年版，19-20；倪语星、洪秀华、楼昌斌主编，《现代病原学检验与临床实践》，上海上海科学技术文献出版社，1999年146)。目前，在乙型肝炎的两对半诊断中，HBeAg诊断也是其中很重要的一部分，因此HBeAg的抗体的研制具有重要的临床使用价值。目前，HBeAg的检测方法有放射免疫检测法(RIA)和酶联免疫吸附检测法(ELISA)等。由于RIA法所需设备昂贵、操作复杂、价格高、易污染等缺点而使其使用受到很大限制，这一限制为ELISA法的使用提供了广阔的市场。Imai M等人利用单克隆抗体技术制备出单克隆抗-HBeAg(a，b)两株杂交瘤细胞后，使检测HBeAg的方法在特异性和敏感性方面达到了一个新水平(Imai M，免疫学杂志(J.Immunol)，1982，12869)。由于单克隆抗一HBeAg杂交瘤细胞株难以获得，也由于其分泌的抗-HBeAg单克隆抗体不配对而无法用于ELISA检测，因此，在检测HBeAg时，往往采用包被单抗、酶标多抗，这会导致假阳性率高、敏感性低等技术缺陷，因此采用双抗体夹心-ELISA法检测HBeAg是必然趋势。但是双抗体夹心ELISA法需要两个识别HBeAg不同表位的单克隆抗体，而利用传统的方法制备抗-HBeAg单克隆抗体时往往只能得到识别HBeAg一个优势表位(命名为b表位)的抗体，这给夹心法ELISA检测HBeAg的临床应用造成了很大限制。
技术实现思路
为了克服上述现有技术中存在的缺乏识别HBeAg不同表位的单克隆抗体这样的技术缺陷，专利技术人进行了广泛而详细的研究工作，包括对传统的单克隆抗体技术的改进、制备和筛选识别HBeAg不同表位的单克隆杂交瘤细胞、抗-HBeAg单克隆抗体的制备及其在检测HBeAg中的应用等。基于上述研究，本专利技术所要解决的技术问题之一是提供包括识别HBeAg不同表位的抗-HBeAg单克隆抗体的试剂盒。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供包括识别HBeAg不同表位的抗-HBeAg单克隆抗体的试剂盒在检测HBeAg中的用途。为了解决上述技术问题，本专利技术的构思是这样的为了在获得识别优势表位抗体的同时能够获得不同于优势表位抗体的抗体，人为改变机体对抗原不同表位反应性的相对强弱。在免疫前先静脉注射识别HBeAg优势表位(b表位)的单抗。另外还可以在每次免疫前将抗原HBeAg和b表位的单克隆抗体反应，然后再进行免疫。这样增加了获得b表位之外的其他表位的抗体的几率。经分离脾脏B淋巴细胞、与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，然后筛选杂交瘤细胞并进行杂交瘤细胞克隆化最终获得产生抗-HBeAg单克隆抗体的细胞株。通过体外培养或体内腹水法扩增上述细胞株，然后从细胞培养液或组织液体(如腹水)中分离抗-HBeAg单克隆抗体。获得的抗体识别HBeAg不同的表位，用辣根过氧化物酶标记其中的一个抗体，可用于双抗体夹心法ELISA检测HBeAg。进一步专利技术人制备了包含识别不同表位的双抗体检测HBeAg的试剂盒。本专利技术理论根据是免疫学的两个基本原理第一，用识别一个表位的抗体可以对这个表位进行封闭；第二，机体内产生抗体具有一个负反馈调节机制，即当机体内已经有大量的识别一个表位的抗体存在时，再注射抗原，机体对这个表位的反应性会被负反馈调节，从而抑制了这个表位的抗体的产生水平，而对其他表位的反应水平相对提高。在本专利技术中，专利技术人用HBeAg免疫动物，第一次免疫前先静脉注射大量识别HBeAg的b表位的抗体，第一次免疫用福氏完全佐剂与HBeAg混合后乳化按照本领域公知的方法免疫动物，第二次、第三次免疫用福氏不完全佐剂与HBeAg混合后乳化免疫动物，第三次免疫后再用HBeAg回忆刺激动物，取血清检测抗体效价。优选地在每次免疫前将HBeAg和优势表位(b表位)的抗-HBeAg单抗预先反应后再免疫动物。免疫动物的抗原或者是商品化的乙型肝炎病毒e蛋白(HBeAg)或者用本领域普通技术人员所公知的基因工程技术制备的HBeAg(HBeAg的氨基酸序列是公知的，Sequence ID No.1)。免疫动物可以是本领域常用的动物如家兔、小鼠等，优选地使用BALB/C小鼠。免疫方法、免疫剂量、免疫间隔时间等因使用不同的动物会有所不同，但本领域的技术人员可以根据公知的技术(如根据金伯泉主编，《细胞和分子免疫学实验技术》，西安，第四军医大学出版社，2002年)方便地实施之。血清抗体效价用双向琼脂扩散法或间接ELISA法检测。免疫小鼠前先注射0.1mg～5.0mg识别HBeAg优势表位的抗体、优选地注射0.1～2.0mg识别HBeAg优势表位的抗体。每次免疫前使0.05mg～0.2mg HBeAg和0.1～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体混合乳化后注射免疫小鼠。优选地免疫小鼠前先注射0.5mg～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体，然后每次免疫前使0.1mg～0.2mg HBeAg和0.5～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体混合乳化后注射免疫小鼠。从回忆刺激后的动物脾脏中分离脾脏B淋巴细胞，在常规条件下用聚乙二醇(PEG)作融合剂将脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，用含有1×HAT(次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T))和10％小牛血清的细胞培养液进行选择培养。50×HAT有商品化产品，其含有5mM的H、0.02mM的A和0.8mM的T。按照本领域常规的方法进行细胞融合，培养液是RPMI1640。融合杂交瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测乙型肝炎病毒ｅ抗原的试剂盒，其特征在于包括包装于容器中的识别乙型肝炎病毒ｅ抗原不同表位的单克隆抗体，任选地其中一种抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙兵，靖彩英，颜凌晨，黄超锋，蔡兴锋，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]