本发明专利技术涉及一种针对ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原的单克隆抗体，以及使用竞争ＥＬＩＳＡ与所述单克隆抗体的抑制率小于５０％，优选的小于２５％的单克隆抗体。本发明专利技术还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体；一种使用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＥＶ抗原的试剂盒，其含有前述抗体组合物；以及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法检测样品中ＨＥＶ抗原的体外方法。本发明专利技术还涉及所述抗体组合物用于检测ＨＥＶ抗原的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体，以及使用竞争ELISA与所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。本专利技术还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体；一种使用双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其含有前述抗体组合物；以及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。本专利技术还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
技术介绍
戊型肝炎病毒(HEV)为肠道传播非甲非乙型肝炎(EntericallyTransmitted non-A，non-B hepatitis，ET-NANBH)的主要病原体。过去认为，戊型肝炎主要流行于非洲和亚洲等不发达地区，随着近年来对戊型肝炎病毒(HEV)研究的深入以及相关检测手段的完善，在欧洲、美国和日本越来越多的非输入性HE病例见诸报道，HEV的流行情况远比先前想象的严重，因此HEV病毒的检测工作越来越得到重视。流行病学研究表明，从感染HEV到出现临床症状的时间在15-60天左右，病程持续时间1-6周。而在实验感染中，志愿者感染HEV后大约36天出现临床症状。现有的戊型肝炎病原学检测主要有以下几种方法1.免疫学检测免疫学检测方法针对抗HEV抗体，主要采用酶联免疫检测方法，检测血清中的抗HEV IgM、IgA和IgG抗体。由于HEV抗体的不同型别对于HEV感染的检测具有不同的意义，故HEV抗体检测试剂需要针对抗HEV的不同型别抗体分别进行检测。目前的HEV IgG检测试剂采用间接法，这种方法特异性不高，而且抗HEV IgG抗体在感染后持续时间很长，因此，仅仅检测IgG抗体不能有效的区分既往感染、近期感染和急性感染。此外，抗HEV IgG抗体在非流行地区阳性率为1-5％，但在HEV流行地区25岁以上人群中阳性率可达40％，对戊型肝炎急性感染的诊断存在一定的干扰作用，IgM抗体作为急性感染和/或近期感染的标志，具有比IgG更高的诊断价值。IgM抗体作为感染后最早出现的抗体，存在亲和力和特异性低的缺点，IgM抗体的这种特性决定了HEV IgM抗体检测试剂存在敏感性和特异性都较低的缺点。而且目前的IgM检测试剂多采用间接法或捕获法，Yu et al建立的捕获法的灵敏度高于经典间接法，但人体内IgM-类风湿因子和抗HEV IgG的同时存在可能引起假阳性，因为IgM-类风湿因子可以和抗HEV IgG的Fc段桥联，通过对样品进行稀释来提高试剂的特异性，但这样做的同时又降低了试剂的敏感性。Chau et al认为，IgA抗体也可以作为HEV近期或急性感染的标志抗体，虽然IgA抗体阳性持续时间与在HEV感染诊断中的意义还有待临床和流行病学研究的进一步证实。目前，国际上公认的HEV抗体ELISA检测试剂为Genelab公司和Abott公司的HEV抗体检测试剂盒，它们均采用HEV 1型和2型抗原为检测抗原。2.分子生物学检测分子生物学检测是指使用RT-PCR方法检测血清、粪便和组织等样本中的HEV病毒基因组RNA。然而，作为肠道传播病毒，HEV病毒血症持续时间很短，许多病人就医时已度过病毒血症期或已接近末期，血液中的病毒RNA拷贝数很低，难以通过RT-PCR检出，这种情况在医药卫生条件不发达的发展中国家尤其突出。粪便排毒虽然持续时间略长于病毒血症，但样品采集困难，易受污染且粪便中可能存在影响PCR的物质。目前报道的RT-PCR在HE病人中检出的阳性率存在很大的差别，从30％至80％不等，这可能与样品采集时间、样品保存情况、引物匹配、PCR条件和其它不确定因素有关。因此，目前检测HEV RNA的RT-PCR诊断方法仅用于实验室研究，还没有商品化的试剂被临床采用。已知HEV在感染机体后进行复制，产生足够量病毒后可引起肝组织的损伤，临床上表现为肝炎症状，实验室检测则会显示相关酶类呈异常反应，为显性感染；有些感染者机体内虽也有病毒的复制，但没有引起典型的临床症状，为隐性感染。无论是显性还是阴性感染，在感染的早期机体内均存在HEV，如果检测手段足够灵敏，在此期间可检出HEV的核酸和抗原。随着感染过程的进展，病毒可诱发机体产生免疫反应，首先诱导感染者产生抗HEV IgM抗体，并持续一定时间，在IgM产生以后IgG也会随着产生，并持续较长的时间，同时也会产生IgA抗体。随着抗体的产生，机体内病毒的滴度也会逐步降低，最后彻底清除。检测IgM抗体以及IgG抗体的动态变化可以诊断HEV的急性感染，但在抗体产生以前，HEV的病毒核酸和抗原就已经存在，因此检测HEV病毒核酸和抗原可达到更早期诊断的目的。目前有些实验室已发展了HEV核酸检测技术，但其操作繁杂、技术要求高、容易污染、成本较高等缺点限制了其广泛应用。如果开发研制技术要求比较低的抗原检测方法，将会为HEV感染的早期诊断提供很重要的工具。为了及时准确检测HEV感染，长期以来一直迫切需要更为灵敏和准确的快速检测方法。为了解决上述问题，本专利技术人通过采用HEV ORF2作为抗原免疫小鼠，筛选针对所述HEV抗原的单克隆抗体，获得了能够以高灵敏度直接检测样品中存在的微量HEV抗原的试剂盒，从而实现了在HEV感染早期进行准确检测。专利技术概述本专利技术一方面，涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体。本专利技术的另一方面还涉及使用竞争ELISA与本专利技术所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。。本专利技术的另一方面，还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体。本专利技术的再一方面，涉及一种用于双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其中含有前述抗体组合物。本专利技术的又一方面，涉及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。本专利技术还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。专利技术详述现已确认的HEV基因组共存在3个开放读码框(ORF 1-3)。ORF1(约28-5106nt)编码HEV病毒最大的蛋白，该蛋白约186kDa，包括至少4个结构区。到目前为止只有很少实验室能够表达完整的ORF1蛋白，分段表达的ORF1蛋白多应用于功能学研究，目前ORF1片段仅在HEV抗体Western印迹检测试剂中应用，ELISA检测试剂中很少使用。ORF2基因长1980bp(约5147nt-7126nt)，编码分子量约为72kDa的病毒衣壳蛋白。ORF2蛋白有一个111氨基酸的信号序列和三个可能用于分泌表达的潜在的糖基化位点。在HEV感染中抗ORF2蛋白抗体具有重要意义，虽然HEV的感染机理仍未阐明，但作为HEV衣壳蛋白的ORF2蛋白在感染过程中很可能扮演着与宿主细胞膜上的受体结合并诱发病毒脱壳和进入细胞的角色，因此目前已经发现的多数中和抗体都为抗ORF2蛋白抗体。目前用于抗体检测的ORF2蛋白主要来源于昆虫细胞系统表达的完整ORF2蛋白和大肠杆菌系统表达的ORF2蛋白片段，但不同的抗原表现出不同的抗体结合能力，比如ORF2蛋白片段比ORF2蛋白全长能更有效的结合恢复期病人血清中的抗HEV抗体。使用合成肽对ORF2蛋白的抗原性研究过程中，发现ORF2蛋白的12-147、381-504和573-660区域存在较多的能够与HE病人血本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原的单克隆抗体，其为： １）ＨＥＶ－ＮＩＣＰＢＰ０４，由保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００５１９的杂交瘤分泌； ２）ＨＥＶ－ＮＩＣＰＢＰ０７，由保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００５２０的杂交瘤分泌；和 ３）ＨＥＶ－ＮＩＣＰＢＰ５８，其特征在于由保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００５２１的杂交瘤分泌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王佑春，李秀华，张峰，乔杉，
申请(专利权)人：中国药品生物制品检定所，北京万泰生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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