酰化氨基酸水解酶1及其抗体检测肝癌的应用制造技术

本发明专利技术根据酰化氨基酸水解酶１在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达，将其用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记，然后利用酰化氨基酸水解酶１的抗体，可制备成试剂或试剂盒用于检测肝细胞癌。该方法检测准确率高，特异性强，操作简单，可广泛应用于临床诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酰化氨基酸水解酶1及其抗体的一种应用，具体地说涉及酰化氨基酸及其抗体检测肝癌的应用。
技术介绍
肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。现在肝癌的诊断和检测技术除了内科和手术诊断外，还有几种如甲胎蛋白之类的分子诊断。内外科诊断的问题在于难于在早期无创的进行诊断；分子诊断的问题是，所用的标志蛋白质分子种类少，对早期肝癌的灵敏度和特异性较差。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。酰化氨基酸水解酶1亦简称酰基转移酶1(ACY 1，ACYLASE，L-amino acidacid amidohydrolase，N-acyl，N-acyl-L-amino-acid amidohydrolase，EC3.5.1.14)。它的Genebank登录号为gi|4501901|，NCBI的登录号为NP_000657，Swissprot登录号为Q03154，IPI号为IPI00009268.1。酰化氨基酸水解酶1(ACYl)是一种同源二聚体的金属蛋白酶，它含有锌指结构，催化水解N酰化的氨基酸，它的催化活性可以如下表示An N-acyl-L-amino acid+H2O＝a carboxylate+an L-amino acid(http//www.expasy.org/uniprot/Q03154)。酰化氨基酸水解酶1的单亚基分子量为40-45KDa之间，该酶基因位于基因图谱的3p21.1位点。经研究表明该基因在小细胞肺癌(SCLC)中显著的低表达甚至表达缺失。运用酶活力测定的方法学以及ELISA测定表明，在14％的小细胞肺癌的细胞系中完全检测不到酰化氨基酸水解酶1的表达，在48％的小细胞肺癌的细胞系中酰化氨基酸水解酶1表达显著降低(THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY Val.268，No.23，Issue of August 15，pp.17010-17017.199)。另有文献报道，在小细胞肺癌中酰化氨基酸水解酶1的表达缺失或低表达是因为该酶基因的缺失，但是具体的机制还未研究清楚。(The Journal of Clinical Investigation，Inc.Volume 83，June 1989，2120-2124)但是到目前为止，现有技术中未见有关于酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的相关性的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供了酰化氨基酸水解酶1及其抗体诊断肝癌的应用，以解决现有技术中存在的缺陷。本专利技术的原理为通过筛选在肝细胞癌癌组织以及肝细胞癌癌旁组织中差异表达的蛋白质，专利技术人找到了一种在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白质，经质谱鉴定为酰化氨基酸水解酶1(见附图中的图1和图2，显示了蛋白质点SSP5401为经质谱鉴定的酰化氨基酸水解酶1，其在肝细胞癌患者的癌组织中的表达相比在癌旁组织中的表达明显下调)。进一步的免疫印迹实验证实，酰化氨基酸水解酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(见附图中的图3和图4，显示了蛋白质点SSP 1009，为经质谱鉴定的酰化氨基酸水解酶1，其在肝细胞癌患者的癌组织中的表达相比在癌旁组织中的表达明显下调)。基于酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌。本专利技术首先提供了酰化氨基酸水解酶1作为检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。其中所述用作检测肝癌的蛋白质分子标记是检测该蛋白在肝组织中的表达量。具体地说是检测该蛋白在肝组织中是否存在下调表达。该蛋白质在肝癌组织中较正常组织下调。本专利技术还提供了抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的制剂的应用，以及抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的试剂盒的应用。其中抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术还提供了一种体外检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达量的方法，包括以下步骤A、用特异性抗酰化氨基酸水解酶1的抗体检测待测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的数量；B、将步骤A测得的酰化氨基酸水解酶1的数量与正常肝组织中的酰化氨基酸水解酶1的数量进行比较，如测得的蛋白数量低于正常值，则表示被检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达异常。其中所述抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。到目前为止，还没有酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的相关性的报道，因此，本专利技术的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。用酰化氨基酸水解酶1及其抗体用来检测肝癌，实验中其准确率为100％，较目前的检测技术有了质的突破，而且方法特异性强，稳定性好，利于在临床中推广应用。附图说明图1酰化氨基酸水解酶1在癌组织中的2-DE质谱2酰化氨基酸水解酶1在癌旁组织中的2-DE质谱3酰化氨基酸水解酶1在癌组织中的分析型双向荧光差异凝胶电泳4酰化氨基酸水解酶1在癌旁组织的分析型双向荧光差异凝胶电泳5酰化氨基酸水解酶1单向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图(～43KDa)图6酰化氨基酸水解酶1单向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图(～70KDa)具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本申请的专利技术人用非酶解样品制备法(nonenzymatic samplepreparation，NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以双向凝胶电泳(2-DE)技术筛选在癌组织与癌旁组织中差异表达的蛋白质点并质谱鉴定，结果发现酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌癌组织中下调表达，并进一步采用双向荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional fluorescencedifference gel electrophoresis，2D-DIGE)筛选在癌组织及癌旁组织中差异表达的蛋白质点并质谱鉴定，结果也发现酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌癌组织中下调表达。免疫印迹实验进一步证实酰化氨基酸水解酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组本文档来自技高网...

【技术保护点】
酰化氨基酸水解酶１作为检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李辰，周晓，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]