生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法技术

披露了用一种乙内酰脲酶由５－取代的乙内酰脲生产Ｄ－Ｎ－氨基甲酰基－α－氨基酸的方法，所述乙内酰脲酶由一种用含有编码乙内酰脲酶的基因的ＤＮＡ片段和一种载体ＤＮＡ的重组ＤＮＡ转化的转化型微生物生产，所述乙内酰脲酶源自芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、农杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）或假单胞菌属的一种具体微生物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。更具体地讲，本专利技术涉及用一种新型转化体，该转化体具有编码一种酶的基因，该酶能通过不对称裂解水解作用将5-取代乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸(以下将所述酶称作乙内酰脲酶)。旋光D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸可被转化成相应的D-α-氨基酸，而旋光D-α-氨基酸是重要的制药用中间化合物。具体地讲，工业用化合物包括用作生产半合成青霉素和半合成头孢菌素的中间化合物的D-苯基甘氨酸和D-(P-羟苯基)甘氨酸。为了生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，已知采用能通过不对称裂解水解作用将5-取代乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的微生物酶促反应的方法，所述方法披露于JP-A 53-91189、JP-A 53-44690、JP-A 53-69884、JP-A53-133688等中。此外，由嗜热微生物获得了一种与乙内酰脲酶有关的基因(所述酶是一种能将5-取代的乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶)并将该基因插入中温微生物中以产生具有乙内酰脲酶活性的转化型微生物。另外，在WO 94/00577中，乙内酰脲酶基因片段是从属于农杆菌属(Agrobacterium)的微生物中提取，并将其导入大肠杆菌(E.Coli)或农杆菌属的一种微生物中，以表达这种酶的活性。上述利用微生物酶促反应的方法具有以下缺陷已知为所述酶的来源的微生物的酶产量不足，而且，培养基昂贵。另外，就JP-A 62-87089中所披露的转化型微生物而言，其酶促活性仅比具有乙内酰脲酶活性的孢子形成嗜热微生物高几倍，而且酶的产量仍然不足。此外，现有技术中尚没有用上述转化型微生物对5-取代乙内酰脲进行不对称裂解水解以便产生和积累相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的先例。本专利技术就是为了解决上述问题，而且涉及创造一种具有极高的酶产量的微生物，还涉及用由此所获得的酶源有效地生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。JP-A 62-87089和WO 94/00577披露了通过重组DNA技术获得乙内酰脲酶生产微生物的方法。不过，用于提供乙内酰脲酶基因的来源微生物完全不同于在本专利技术中被用于获得乙内酰脲酶基因的微生物。另外，所述乙内酰脲酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列明显不同于本专利技术的有关序列本专利技术提供了一种用于，该方法包括在一种含水介质中使5-取代乙内酰脲与乙内酰脲酶反应，该乙内酰脲酶是由一种转化体产生，而转化体又是通过用含有源自芽胞杆菌KNK245(FERMBP-4863)、农杆菌KNK712(FERM BP-1900)或假单胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙内酰脲酶编码基因的一种DNA片段和一种载体DNA的重组DNA转化一种宿主微生物，如属于埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、黄杆菌属、芽胞杆菌属、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属、棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物而获得的。迄今为止，现有技术中尚未见具有极高乙内酰脲酶生产能力的转化体，如在本专利技术中所得到的转化体，而且，通过利用该转化体的酶的反应能够极为有效和经济地生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。随后，将结合附图对本专利技术做详细说明。附图说明图1是质粒pAH1043的限制酶图。图2是质粒pTH102的限制酶图。图3是质粒pTH103的限制酶图。图4是质粒pTH104的限制酶图。图5是质粒pPHD301的限制酶图。图6是质粒pTHB301的限制酶图。可以从芽胞杆菌KNK245、农杆菌KNK712或假单胞菌KNK003A获得带有用于本专利技术的基因的DNA片段。农杆菌KNK712和假单胞菌KNK003A已由本专利技术人保藏于NIBH(National Institute of Bioscience and Human Technology)，A-gency of Industrial Science&Technology，Ministry of internationalTrade&Industry，保藏编号分别为FERM BP-1900和FERM BP-3181，这些菌株详细披露于Wo 92/10579中。芽胞杆菌KNK245是由本专利技术人新发现的菌株，并于1994年11月2日提交NIBH保藏，保藏编号为FERM BP-4863。芽胞杆菌KNK245的微生物学特征如下芽胞杆菌KNK245形状棒状，丝状大小0.5-0.8×3-10(μm)革兰氏染色 +孢子 +游动性 -生长温度37-60℃生长pH 5.0-8.9生长于5％NaCl中-生长于7％NaCl中-生长于0.02％叠氮化物中 -生长于0.001％溶菌酶中 -硝酸还原 -淀粉水解 +酪蛋白分解 +酪氨酸分解 -过氧化氢酶 -氧化酶 +吲哚产生 -鼠李糖-萄萄糖+果糖 +棉子糖-蔗糖 +麦芽糖+乳糖 -为了从所述菌株中获取乙内酰脲酶基因，通常采用以下方法。首先，从一种微生物细胞中提取基因组DNA，然后用合适的限制酶，如Sau3AI等对该DNA进行部分水解。将所得到的片段连接到载体DNA上，以得到具有各种基因组DNA片段的重组DNA分子作为基因文库(见JP-A 58-126789和US 4,237,224)。然后，从该基因文库中选择带有所需基因的重组体。例如，可以通过检测表达蛋白的酶促活性进行选择，或通过分析蛋白的N-末端序列，合成相应的DNA探针并通过菌落杂交等检测目的基因的存在。另外，可以采用DNA引物通过菌落杂交或聚合酶链式反应(PCR)方法获得所需要的基因，所述DNA引物是合成的已知乙内酰脲酶碱基序列的合适部分。一旦得到目的基因，即分析其核苷酸序列。另外，对一种乙内酰脲酶生产微生物和一种含有该酶基因的重组体进行培养。纯化所得到的酶，并测定所得蛋白的分子量。同时，用一台气相蛋白测序仪或类似装置测其N-末端部分的氨基酸序列。接着，通过比较所述DNA核苷酸序列和N-末端氨基酸序列，确定编码乙内酰脲酶蛋白的核苷酸序列部分翻译成蛋白的起始位点，而且，通过考虑其与该蛋白分子量的关系证实，该酶蛋白是由所述基因上从该起始位点至终止密码子的部分编码，从而证实了所述目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，从农杆菌KNK712和芽胞杆菌KNK245中获得了序列1、2和3的DNA片段。众所周知，编码由此获得的酶的基因和/或目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，从芽胞杆菌KNK245、农杆菌KNK712和假单胞菌KNK003A中获得了序列1、2和3的DNA片段。众所周知，编码由此获得的酶的基因和/或带有该基因的DNA片段与具有编码相应于上述基因和/或DNA片段的氨基酸序列的另一种核苷酸序列的DNA片段相同，因为一个氨基酸通常相应于若干个碱基密码子。可用于本专利技术的载体包括质粒、噬菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化型微生物，它是用含有编码一种酶的基因的ＤＮＡ片段和一种载体ＤＮＡ的重组ＤＮＡ转化宿主微生物所获得的，所述基因源于芽胞杆菌ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ－４８６３）或假单胞菌ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ－３１８１），所述酶（以下称之为乙内酰脲酶）能通过不对称裂解水解作用将５－取代乙内酰脲转化成相应的Ｄ－Ｎ－氨基甲酰基－α－氨基酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：难波弘宪，矢岛丽嘉，高野昌行，山田勇喜雄，池中康裕，高桥里美，
申请(专利权)人：钟渊化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]