本发明专利技术提供了一种新型的Ｄ－酰化氨基酸水解酶，它是对由甲基杆菌嗜中温菌属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｕｍ）ＭＴ１０８９４等得到的新型Ｄ－酰化氨基酸水解酶的编码ＤＮＡ进行克隆得到的，它对在工业有效基质浓度下有效进行由Ｎ－酰基－ＤＬ－氨基酸制备Ｄ－氨基酸的反应具有足够高的活性；本发明专利技术还提供了一种编码Ｄ－酰化氨基酸水解酶的ＤＮＡ，以及使用含有这种ＤＮＡ的转化体来由相应的Ｎ－酰基氨基酸制备Ｄ－氨基酸的一种方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在工业有效的基质浓度下具有高活性的，特别是一种可以使D-色氨酸由N-乙酰基-DL-色氨酸经立体选择而高效获得的新型D-酰化氨基酸水解酶，以及一种使用这种酶由N-酰基氨基酸制备D-氨基酸的方法。本专利技术还涉及一种编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列，一种含有这种序列的质粒，以及由这种质粒转化而得到的转化体。本专利技术还涉及一种使用这种转化体制备D-酰化氨基酸水解酶的方法。本专利技术还涉及一种通过将D-酰化氨基酸水解酶的转化体、其培养基或者其加工物作用在N-乙酰基氨基酸上的反应来制备一种相应的光活性的D-氨基酸的方法。
技术介绍
D-氨基酸是许多杀虫剂、抗生素和医药的重要中间体。对于它们的合成已进行了许多的研究。到目前为止，合成DL-氨基酸可以通过物理化学、化学或酶的方法实现，其中，酶方法被认为是最方便和有效的。例如在一个已知的利用酶方法的例子中，使用D-酰化氨基酸水解酶将N-乙酰基-DL-氨基酸直接水解得到相应的D-氨基酸。已知的D-酰化氨基酸水解酶包括属于细菌、放线菌和霉菌的微生物，例如，假单胞菌(日本专利公开(JP-B)60-31477)、链霉菌(JP-B53-36035)、产碱杆菌(JP-B 07-83711)、Rhodococcus，Pimelobacter(日本专利请公开(JP-A)06-227789)、节核细菌、棒状杆菌、欧文氏菌、埃希氏杆菌、黄杆菌、Norcadia、精蛋白杆菌、黄(单胞)杆菌(日本专利申请公开(JP-A)11-113592)、Amycolatopsis(JP-A 11-98982)、Sebekia(JP-A 11-318442)、Hypomyces、镰刀菌、Auricularia、Pythium、Menisporosis(JP-A 12-41684)。已经有过用这些微生物得到的D-酰化氨基酸水解酶作用在N-酰基氨基酸上反应制备D-氨基酸的报道。然而，这些D-酰化氨基酸水解酶的活性对于有效的基质浓度来说却是不够的，因而就需要有一种工业上可应用的D-酰化氨基酸水解酶。特别的是，在水解N-乙酰基-D-色氨酸时，这些酶的活性对于有效的基质浓度来说是不够的。因此，它们都不能被称为是满足工业需要的酶。近来，Tokuyama(JP-A 13-275688)和Taylor(Chirotech Technology Limited，WO 00/23598)公开了一种作用于N-乙酰基-D-色氨酸以制备D-色氨酸的D-酰化氨基酸水解酶，该D-酰化氨基酸水解酶分别选自Hypomyces和产碱杆菌。这些D-酰化氨基酸水解酶中的任何一种都只能使N-乙酰基-D-色氨酸水解到10g/L，不能认为是有效浓度下催化反应的酶。D-氨基酸是医药的重要原料，因此需要找到一种生产成本更低的方法来生产D-氨基酸。到目前，尚未发现一种能有效催化氨基酸的D-酰化氨基酸水解酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的在工业有效基质浓度下显示出有效高活性的D-酰化氨基酸水解酶，使用该酶能够有效地由N-乙酰基-DL-氨基酸得到D-氨基酸，以及提供一种使用该酶由N-酰基氨基酸制备D-氨基酸的方法。本专利技术的另一目的是提供一种D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列编码，该D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列编码是生产D-酰化氨基酸水解酶以及用D-酰化氨基酸水解酶生产D-氨基酸的有用材料；一种含有碱基序列的质粒；以及由这种质粒宿主转化而得到的转化体。在解决问题的同时，我们还对由众多微生物得到的D-酰化氨基酸水解酶的性能进行了评价。在研究基质浓度和反应速率的关系时，我们惊奇地发现，在一种已知的D-酰化氨基酸水解酶中，更高的基质浓度更显著地降低了它的反应速率，即是说，抑制了酶的活性。这一现象当基质是N-乙酰基-D-色氨酸时尤为显著。我们猜想，在普通的D-酰化氨基酸水解酶中，这种现象可能会使得在有效的基质浓度下，由N-乙酰基-DL-色氨酸生产D-色氨酸的无效性。因此，为了寻找一种新型的能够在高的N-乙酰基-D-色氨酸基质浓度下仍显示出高活性而其活性不受抑制的D-酰化氨基酸水解酶，我们测试了各种不同的微生物，最后，发现了能满足上述要求的表现新型D-酰化氨基酸水解酶活性属于甲基杆菌(Methylobacterium)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物。通过各种纯化方法的结合使用，我们成功地测定了源自属于甲基杆菌(Methylobacterium)的微生物的D-酰化氨基酸水解酶的氨基酸序列，得到了序列表SEQ.ID.No.3中N-端基氨基酸残基的氨基酸序列。我们还获得了具有序列表SEQ.ID.No.1中序列的DNA，并由含有此序列的DNA碎片质粒制得了转化体，还制得了活性态的D-酰化氨基酸水解酶，并在有效的基质浓度下高效地由N-乙酰基氨基酸制得了相应的D-氨基酸。由此完成了本专利技术。基于上述的新观察得到的本专利技术包括了以下方面(1)一种能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成相应的D-氨基酸反应的D-酰化氨基酸水解酶。其中在水介质中由N-乙酰基-D-色氨酸经催化反应生成D-色氨酸时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。(2)根据(1)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。(3)根据(1)中所述的D-酰化氨基酸水解酶是由属于甲基杆菌(Methylobacterium)或类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物得到的。(4)根据(3)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中属于甲基杆菌(Methylobacterium)的微生物是甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)，属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus。(5)根据(4)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。(6)一种能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反应的D-酰化氨基酸水解酶，其包括(A)序列表中SEQ.ID.No.2所示的氨基酸序列，或者(B)在保持催化活性下，由插入、缺失或替换上述的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基而得到的变异的氨基酸序列。(7)根据(6)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中在水介质中由N-乙酰基-D-色氨酸经催化反应生成D-色氨酸时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。(8)根据(7)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。(9)一种编码了能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反应的D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列，其包括(a)序列表中SEQ.ID.No.1所示的碱基序列，或者(b)在保持由上述的碱基序列中编码的D-酰化氨基酸水解酶的催化活性下，由插入、缺失或替换碱基序列SEQ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够作用于Ｎ－酰基－Ｄ－氨基酸而催化生成相应的Ｄ－氨基酸反应的Ｄ－酰化氨基酸水解酶，中在水介质中由Ｎ－乙酰基－Ｄ－色氨酸经催化反应生成Ｄ－色氨酸时，Ｎ－乙酰基－Ｄ－色氨酸浓度为５０ｇ／Ｌ时的反应速率至少是其浓度为５ｇ／Ｌ时的４０％。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：长部雅己，高桥克幸，八卷俊文，有井辉夫，及川利洋，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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