一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人源化抗ＣＤ５２抗体生物活性的方法，此方法包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用ＣＤ５２阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的ＣＤ５２阳性细胞为ＣＨＯ－Ｃ细胞。本发明专利技术使用的ＣＨＯ－Ｃ细胞具有灵敏度高、稳定性好的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及到一种检测抗体生物活性的方法。
技术介绍
CD52又称CAMPATH-1抗原，该抗原表达于正常及恶性的B和T淋巴细 胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织，是一种存在于 B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的抗原。针对CD52抗原的单克隆抗体在体内可 以暂时清除血液内的淋巴细胞，使免疫系统处于失效状态，使器官移植入患者 体内，不会遭到患者免疫系统的排斥，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致 抗体依赖性溶解细胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响细胞中 的恶性淋巴细胞。抗CD52单克隆抗体(CAMPATH-1系列)已经被广泛地用于临 床治疗，此抗体为人源化抗CD52抗体，于2001年5月7日获得美国FDA批准 上市，适应症为"烷化剂及氟达拉宾治疗无效的慢性B淋巴细胞性白血病"。人源化抗CD52抗体为IgGl亚型，具有人类抗体可变区的框架区、恒定区， 以及来源于大鼠单克隆抗体(Campath-1G)的互补决定区。人源化抗CD52抗 体的分子量约为150kD。对于抗体生物活性的检测方法通常有两类， 一为基于结合某种类型的抗原 (对于CD52抗体，为CD52抗原)上，而后再检测所结合的抗体的方法(ELISA， ADCC， CDC)，另一为已知浓度的标记抗体竞争结合(对于CD52抗体，为利 用CD52表达的外周血单个核细胞或细胞系)的方法。上述方法存在着许多诸如利用合成的CD52抗原，合成的抗原与天然抗原相比亲和力较低，因此检测方法的灵敏度较差；利用天然的CD52抗原，来源 困难(人类脾脏)，不同来源的抗原有很大的差异，纯化的抗原有聚集的趋势；利用抗CD52独特型抗体代替CD52抗原，检测的灵敏度低，或与血清Ig有不 可避免的交叉反应;利用新鲜外周血单个核细胞，不同供者间CD52表达的差异， 病毒污染，难以获得均一的足够量的一大批；其他膜抗原的差异导致的非特异 结合；利用CD52阳性的细胞系，Fc受体导致的假阳性，检测灵敏度较差；ADCC 或CDC方法，同位素的使用使可操作性下降，检测的灵敏度及精密度较差等问 题。
技术实现思路
为了得到长期传代稳定、密度均一的而且细胞膜表面稳定表达CD52抗原 细胞的CD52阳性细胞，本专利技术的申请人进行了大量实验，得到了符合此要求的 CD52阳性细胞CHO-C，并建立了利用此细胞对人源化抗CD52抗体生物活性进 行检测的方法。本专利技术的目的之一是公开一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法，包 括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用CD52阳性细胞进行竞争结合试 验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的 CD52阳性细胞为CHO-C细胞。上述检测方法的主要原理为转染CD52的CHO-C细胞，其细胞膜表面表达 CD52，抗CD52抗体可与CD52特异结合。单纯研究荧光标记抗体与细胞的结 合的情况，量效曲线应为"S"形，即随着标记抗体浓度的增加，荧光强度也逐渐 增加，直至达到饱和；此时的IC5。可代表该抗体与CD52的结合活性，在靶细胞相同的情况下，IC5。值越小，抗体与CD52的结合能力就越强，即抗体的活性 越好。若存在未标记抗体对标记抗体的竞争，在荧光标记抗体浓度固定(结合 曲线的亚饱和点)的条件下，随着加入的未标记抗体浓度的增加，细胞结合的 荧光标记抗体量逐渐减少，因此量效曲线呈反"S"形或"乙"字形；在靶细胞和标 记抗体相同的条件下，IC5。值越小，则说明加入的未标记抗体与标记抗体竞争的 能力越强，与CD52的结合能力越强，即抗体的活性越好。本专利技术的另外一个目的，是公开了上述的CHO-C细胞，通过人CD52 cDNA 的获取、表达载体构建、转染CHO细胞及筛选获得；其中人CD52 cDNA的获取 和表达载体构建过程包括引物序列的设计、人CD52特异片段的获得及将该片段 装入表达载体。本专利技术进一步公开了得到上述的CHO-C细胞需要的引物序列有义引物5， -CAAGCTTCACCATGMGCGCTTCCTCTTCCTC-3， (SEQ ID NO. 1)反义引物5， -C|GAATTC|TCAACTGAAGCAGAAGAGGTG-3， (SEQIDNO. 2) 该对引物在互补区两侧分别加入了酶切位点用于装入表达载体。 本专利技术还公开了 CHO-C细胞的表达载体，可以为pcDNA3. 1、pcDNA4、pCEP4、 pREP4之一 ，优选pcDNA3. 1 。本专利技术公开的转染了人CD52基因的CHO细胞经过荧光染色法和免疫组化 法进行了鉴定，通过荧光染色法鉴定结果表明CHO-C细胞被标记后，可以使染 色荧光强度的峰明显右移，即FITC- rhCD52mAb可以使CH0-C染色；通过免疫 组化法鉴定结果表明转染CD52的CHO-C细胞，可被抗CD52抗体染色，抗原位 于细胞膜表面。本专利技术的申请人对本专利技术公开的检测方法中利用的CHO-C细胞在体外连续传代培养，3个月(隔天传代，共计传45代)后进行CHO-C细胞的鉴定实验， 荧光染色法、CH0-C细胞的鉴定实验，免疫组化法以及RT-PCR测定细胞中 CD52mRNA的含量，与构建之初比较，没有显著差异。证明了本专利技术公开的CHO-C 细胞不仅具有细胞膜表面稳定表达CD52抗原，长期传代对CD52的表达几无影 响的优点，还具有荧光标记抗CD52抗体染色CV值较小，细胞表面表达CD52 的密度均一和细胞膜表面CD52密度较高，从而使荧光抗体染色时具有较高的灵 敏度的优点。本专利技术还公开了利用上述的CH0-C细胞来进行人源化抗CD52抗体生物活性 检测的详细步骤，包括1. 用PBSS分别稀释参比品和待测样品到一定浓度；2. 用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人源化抗CD52单抗(以下简称 FITC-anti-CD52 MAb)继续稀释参比品和待测样品的稀释液；3. 将对数生长期的CHO-C细胞，细胞悬液分至流式专用管中；4. 将2得到的序列稀释液加入3中，并设相应对照组； 上机检测，计算结果。更具体地，其步骤如下1. 取一支分装的参比品，用PBSS稀释至2000(ig/ml，每次稀释倍数不超过 10倍，加入等体积20吗/ml的FITC-anti-CD52 MAb (PBSS稀释)。2. 根据待测定样品的蛋白定量，用PBSS稀释至2000吗/ml，每次稀释倍 数不超过10倍，加入等体积20ng/ml的FITC-anti-CD52 MAb (PBSS稀释)。3. 分别在离心管中用lOpg/ml的FITC-anti-CD52 MAb (PBSS稀释)连续2 倍比稀释工作参比品或样品的稀释液。 4. 取对数生长期的CH0-C细胞，计数，每次测活(1个样品及工作参比品)取约107个细胞，离心弃上清，加入PBSS调整细胞密度至lxl07ml，然后将细 胞悬液分至流式专用管中，0. lml/管。5. 500g离心5分钟弃上清。6. 将待测样品及工作参比品的序列稀释液加入步骤5的流式管中，O. lml/ 管，每一浓度设2复管，另外设3组对照，①只加50叫/ml的FITC-anti-CD52 MAb为空白对照，②加入50^ig/ml FITC-anti-CD52區b及50(^本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人源化抗ＣＤ５２抗体生物活性的方法，此方法包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用ＣＤ５２阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的ＣＤ５２阳性细胞为ＣＨＯ－Ｃ细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯盛，王皓，寇庚，李博华，郭亚军，
申请(专利权)人：上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]