采用动物细胞流加培养方式高效表达单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术提供了一种采用动物细胞流加培养方式高效表达单克隆抗体的方法。该方法选择动物细胞流加培养方式进行单克隆抗体的表达，并在流加培养的不同阶段控制不同范围的细胞培养温度和ｐＨ值，以期达到单克隆抗体高效表达的目的。本发明专利技术操作简便，容易实施，在提高蛋白产量的同时不提高成本，适合于大规模的动物细胞培养，尤其是应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、融合蛋白以及各种基因重组蛋白质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物细胞培养领域。更具体地，本专利技术涉及一种采用动物细胞流加 培养方式表达单克隆抗体的方法。
技术介绍
动物细胞大规模培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、 病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动 物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白 质。动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批 式(Batch)，流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三种操作方式。简单的分批培养 (Batch)中，随着营养物的消耗和副产物积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止 表达，生产效率很低。流加培养(Fed-batch)，即在培养过程中，根据细胞代谢需求， 连续或间歇地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物， 克服了批培养的弊端。流加培养同批培养相比，培养周期延长，能够最终获得更高的 活细胞密度和产物浓度(J.B.Griffith，Animal Cell Culture and Production of Biologicals, pp.401-410, Klumer Academic Publishers, R.Sasaki and K.Ikura(eds.)，(1991), Robbinson DK, Seamans TC， et al.optimization of a fed-batch process for production of a recombinant antibody.Annals NY Academy Sciences, (1994)，745 185-296.)。连续灌流培养 (Perfusion)是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不 断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。目前，流加式 (Fed-batch)培养是动物细胞大规模培养生产分泌型重组蛋白药物较为推崇的一种操作方 式。此外，动物细胞大规模培养的有关研究内容还包括高密度和高表达细胞的培养 环境及条件，促进单个细胞的基因合成和产物表达，改进培养系统的氧传递方式，以及 减少剪切力和降低生产成本的培养条件等。其中，培养温度是影响重组蛋白生产的重 要因素之一，优化培养温度，可提高重组蛋白的产量，与其他方法相比，此方法操作简 便，有较好的实用价值。CN 200510011774.5(专利技术名称为一种高效表达目的蛋白的 方法)公开了一种高效表达目的蛋白的方法，该方法通过优化稳定表达目的蛋白的工 程化CHO细胞株的培养温度，并利用两阶段培养策略，使融合蛋白表达量得到显著提 高。但一些研究表明，仅通过优化培养温度，并不能使重组蛋白的产量提高到理想水 平(Yoon SK, Song JY, Lee GM.EfFect of low culture temperature on specific productivity, transcription level, and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2003, 82(3) 289-98)，这是因为降低培养温度可提高目的蛋白的比 生成率，但同时导致细胞增殖抑制，降低了细胞的相对数量，从而影响了目的蛋白产量 的提高。而且温度不仅仅是影响重组蛋白表达的唯一因素。因此，结合优化培养温度综 合考虑其它因素使重组蛋白高效表达一直是本领域技术人员一直期待解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的申请人公开了一种采用动物细胞流加培养方式高 效表达重组蛋白的方法。包括如下步骤(1)细胞培养温度36°C-38°C，PH值6.5-6.9，培养24-48小时，当动物细胞生 长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；(2)细胞培养温度降至32.5°C -35PH值7.0-7.3，进行流加培养；(3)停止流加，细胞培养温度升至36°C-38°C，PH值7.0-7.3，进行培养。本专利技术选择动物细胞流加培养方式进行重组蛋白的表达，并在流加培养的不同 阶段控制不同范围的细胞培养温度和PH值，通过增加单位体积的细胞数量和单个细胞的 蛋白表达量以期达到重组蛋白高效表达的目的。培养温度是影响重组蛋白生产的重要因素之一。大多数动物细胞适宜的生长温 度在37°C左右。在36°C-38°C的培养温度下，动物细胞增殖速度很快。当温度逐渐下 降，细胞的增殖速度也逐渐减慢，但细胞表达重组蛋白的比生成率则显著提高。因此， 细胞在36°C-38°C下处于生长期，以细胞增殖为主；而在32.5°C-35°C下，细胞增殖受到 抑制，细胞处于维持期，此时以重组蛋白表达为主。PH值的变化是培养环境及条件的另一个重要因素。一定范围的PH环境将有利 于细胞的生长。大多数动物细胞的适宜pH为6.8-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生 有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。对于同 一种细胞.生长期和维持期最适pH也不尽相同。对大多数细胞来说，偏酸环境更利于生 长.而偏碱环境更利于维持。本专利技术方法采用三段法。第一阶段，即流加培养过程步骤(1)中，细胞培养环境温度36°C-38°C，PH值 6.5-6.9。此时的细胞处于旺盛的生长期，选择偏酸的培养环境还有利于减少副产物的产 生，如乳酸累积。培养24-48小时，当细胞生长至适当密度时通过补加流加培养基，让 细胞继续充分生长。第二阶段，即流加培养过程步骤(2)中，细胞培养环境温度32.5°C-35°C，PH值 7.0-7.3。此时的细胞进入维持期，细胞以表达重组蛋白为主。此时选择一定的流加稀释 率和流加时间，尽量使单个细胞的重组蛋白得到充分表达。第三阶段，即流加培养过程步骤(3)中，细胞培养环境温度36°C-38°C，PH值 7.0-7.3。此时的细胞接近生长末期，停止添加流加培养基，再培养一段时间使细胞在适 宜的温度下继续生长，并完成蛋白表达的最后过程。经过以上步骤，于合适的时间收集上清，经检测重组蛋白的产量得到显著提尚o本专利技术选择流加培养方式培养动物细胞，通过生物反应器电加热系统控制培养温度，并通过向生物反应器中通入C02气体使PH值下降或者加入NaHC03溶液使PH值 上升。除了温度和PH值以外的其他培养条件采用本领域的常规做法。本专利技术与CN 200510011774.5 (专利技术名称为一种高效表达目的蛋白的方法)公 开的细胞两阶段培养方法相比较，在细胞大规模培养(50升及以上规模)生产重组蛋白方 面，本专利技术三段法的蛋白表达量高于对比文献两段法的蛋白表达量30%以上，对于重组 蛋白药物产业化更具有实际意义。本专利技术利用动物细胞的生长特点，通过改变温度和PH值达到提高重组蛋白产 量的目的。该方法的优点在于操作简便，容易实施，在提高蛋白产量的同时不提高 成本，适合于大规模的动物细胞培养，尤其是应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗 体、融合蛋白以及各种基因重组蛋白质。附图说明图1为本专利技术“三段法”表达重组人II型肿瘤坏死因子受体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用ＣＨＯ细胞流加培养方式高效表达单克隆抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：（１）细胞培养温度３６℃－３８℃，ＰＨ值６．５－６．９，培养２４－４８小时，当ＣＨＯ细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；（２）细胞培养温度降至３２．５℃－３５℃，ＰＨ值７．０－７．３，进行流加培养；（３）停止流加，细胞培养温度升至３６℃－３８℃，ＰＨ值７．０－７．３，进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种采用CHO细胞流加培养方式高效表达单克隆抗体的方法，其特征在于所述方 法包括如下步骤(1)细胞培养温度36°c-38°c，PH值6.5-6.9，培养24-48小时，当CHO细胞生长至 适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；(2)细胞培养温度降至32.5°C-35°C，PH值7.0-7.3，进行流加培养；(3)停止流加，细胞培养温度升至36°C-38°C，PH值7.0-7.3，进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的细胞适当密度为 2.0-3.5X106c...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，寇庚，王皓，侯盛，胡辉，
申请(专利权)人：上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]