抗人CD34人源化抗体、其制备方法及用途技术

本发明专利技术属于生物技术领域。具体地，本发明专利技术公开了抗人ＣＤ３４人源化抗体ｈ４Ｃ８、其制备方法及其在分选骨髓干／祖细胞中的用途。ｈ４Ｃ８抗体能很好地与高表达ＣＤ３４的人髓性白血病细胞特异性结合，可以将它与磁性纳米材料偶联，制备免疫磁珠，来分选骨髓造血干细胞，能有效地减少ＨＡＭＡ的发生率，提高临床造血干细胞移植的安全性，用于某些恶性血液病及实体瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术公开了一种抗体、 其制备方法及用途。
技术介绍
在某些恶性血液病及实体瘤的临床治疗上，造血干/袓细胞 (hematopoietic stem/progenitor cells, HSC)移植已经成为目前公 认的唯一有效的治疗方法。但因移植物中含有大量T淋巴细胞致使移 植后发生急性、重度移植物抗宿主病(graft-versus-host disease GVHD)是影响异基因造血干细胞移植能否获长期生存的主要原因之 一。造血干/祖细胞移植面临的首要问题是如何获得大量纯化的造血 干细胞，以去除杂质细胞对移植的干扰，因此，清除或富集移植物中 特定的细胞是当前移植领域所关注的问题。由于HSC没有明确的形态 学特征，主要表现为淋巴细胞样的单个核母细胞，所以只能以细胞表 面的一些蛋白来鉴定。CD34是一个分子量约110Kd的穿膜糖蛋白，是 目前所能认识的表达在人类HSC上最早期也是最广泛的抗原，是衡量 HSC质与量的较好的标志，随着基于CD34抗体的阳性选择技术的发展， CD34+造血干细胞无论是在实验性动物还是在人身上都显示出重建造 血的功能[Andrews RG，Bryant EM，Bartelmez SH，Muirhead3DT， Knitter GH，Bensinger W， Strong DM，Bernstien ID (1992) CD34+ marrow cells, devoid of T and B Lymphocytes, reconstitute stable lymphopoiesis and myelopoiesis in lethally irradiated baboons.Blood 80:1693] [Shpall EJ， Jones RB， Franklin W， Bearman S， Stemmer S， Hami L， Petsche D， Taffs S， Myers S， Purdy M， Heimfeld S，Halligan J，Berenson RJ(1994)Transplantation of autologous CD34+ hematopoietic progenitor cells into breast cancer patient following high-dose chemotherapy. J Clin Oncol 12:28]， 因此它 们以其独特的生物学特性与功能正成为造血干细胞移植最理想的靶 细胞。目前，应用于细胞分离纯化主要采用贴壁法、差速离心、非连续 性密度梯度法等手段。虽然这些技术解决了不少实际问题，但由于操 作周期长、细胞回收率低、分离纯化成本高，阻碍了细胞生物学的发 展以及细胞生物治疗技术产品的开发和应用。免疫磁珠分选细胞技术 是近年来发展起来的一项新的细胞分离技术，具有简便易行、分离纯 度高、保留细胞活性等优点，可用于分离和检测各种骨髓及血细胞、 肿瘤细胞、细菌及其他微生物等，日益受到生物医学领域科研工作者 的青睐。近几年，免疫磁珠逐步朝着亚微米尺寸方向发展，以使得磁 珠能够在低梯度磁场下简便快速分离细胞，又在实施分离后无需将磁 珠从细胞表面解离而直接进行后续分析与应用，且磁珠对分离后的细 胞活性没有影响。其分离原理为运用抗体特异性亲和作用原理，以 磁性纳米颗粒作为载体将抗体偶联在其表面，磁性纳米颗粒上抗体与待分选细胞特异性表面抗原结合，形成细胞-抗体-磁性纳米颗粒复合 物，在外加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗和解吸等操作， 可以一步从原始细胞混合液中直接分离出靶细胞。纳米磁性细胞亲和 分离具有磁性分离的简单方便和亲和分离的高选择性双重优势。随着免疫磁珠的问世，通过CD34单克隆抗体偶联磁性纳米微球 制备相应的免疫磁珠来分选骨髓造血干细胞已经应用于临床造血干 细胞移植，由于用其分选细胞具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯 度高等优点，已成为某些恶性血液病、重症免疫缺陷和肿瘤放化疗所 至的造血功能低下等疾病的首选疗法。在造血干细胞分选的过程中， 这些抗体将不可避免地伴随着造血干细胞进入人体。杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答human antimouse antibody response (HAMA) [Winter G， Harris WJ. Humanized antibodies. Immunol Today. 1993 Jun;14(6):243-6]。 因此，如何通过基因工程技术来构建抗降低鼠源抗体的免疫原性的抗 体，有效地减少HAMA反应的发生率是本领域的技术人员急于解决的 问题。人源化抗体是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起 来的新型基因工程抗体。第一代人源化抗体是将鼠单抗的可变区和人 抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于抗体的抗原亲和力是由其可变区决 定的，因此嵌合抗体的亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一 定程度的降低。抗体的可变区是由超变区(CDR)区和框架区(FR) 区组成的，CDR是高度可变的区域，直接介导抗体与抗原的结合。FR区相对保守，作为支架维持着CDR区的空间位置，它是可变区中产生 免疫原性的主要区域。由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，临床应用时仍常常会有强烈的HAMA反应。因此，为了尽可能降低嵌合抗体的 免疫原性，人们考虑将鼠CDR区直接移植到人源抗体可变区中的FR 区上，得到CDR移植抗体，也就是人源化抗体。但是，单纯的CDR移 植往往降低甚至丧失原抗体的亲和力，这是因为FR区不仅提供了 CDR 的空间构象环境，有时还直接参与抗原抗体的相互结合，只有将FR 中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性。因此，如 佝确定FR中影响抗体活性的重要残基成为了抗体人源化的关键。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人进行了大量的实验，在申请人于2007年12月13 曰申请的专利技术专利申请号为200710094456.9，专利技术名称为《抗人CD34 抗体、其制备方法及用途》的基础上对抗体CD34的小鼠单抗4C8进行 了人源化改型设计，成功构建了抗CD34人源化抗体h4C8。具体地，本专利技术公开了一种人源化抗CD34抗体，其重链可变区 氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，恒定区为人抗体恒定区。本专利技术还公开了一种编码上述人源化抗CD34抗体的核苷酸序 列，更具体地，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示， 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。本专利技术还公开了含有上述核苷酸序列表达载体，为pc腿3. 1/ZE0(+)和pc廳3. 1 (+)。本专利技术还公开了被上述表达载体转化的宿主细胞为CH0细胞。 本专利技术进一步公开了上述抗CD34的人源化抗体的制备方法，包 括通过计算机辅助设计出人源化抗体h4C8的氨基酸序列，全基因合 成h4C8的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人抗体重、轻 链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的 轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO 细胞，然后进行筛选、培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化抗ＣＤ３４抗体，其重链可变区ＣＤＲ氨基酸序列分别选白ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧ或ＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹ，轻链可变区ＣＤＲ氨基酸序列分别选自ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ、ＱＶＳＮＲＦＳ或ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ。

【技术特征摘要】
CN 2008-1-8 200810043016.51. 一种人源化抗CD34抗体，其重链可变区CDR氨基酸序列分别选白GYTFTNYGMN、WINTNTGEPKYAEEFKG或GYGNYARGAWLAY，轻链可变区CDR氨基酸序列分别选自RSSQTIVHSNGNTYLE、QVSNRFS或FQGSHVPRT。2. 权利要求1所述的人源化抗CD34抗体，其重链Bf变区氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，恒定区为人抗体恒定区。3. —种核苷酸序列，编码权利要求1所述的人源化抗CD34抗体。4. 权利耍求3所述的核苷酸序列，其中编码重链可变区的核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，钱卫珠，李博华，王皓，马菁，
申请(专利权)人：上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]