酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酰胺酶突变体及其在催化合成2‑氯烟酸中的应用，属于酶工程技术领域。所述酰胺酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。本发明专利技术提供的酰胺酶突变体较亲本活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本发明专利技术的酰胺酶突变体能够适应30～55℃的催化温度，为工业化酶法生产2‑氯烟酸奠定了基础。

Amidase mutants and their application in catalytic synthesis of 2-chloronicotinic acid

【技术实现步骤摘要】
酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用。
技术介绍
2-氯烟酸是一种合成农药和医药的重要中间体化合物。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺以及三唑硫酮类的一系列杀菌活性化合物等；在医药领域，2-氯烟酸是合成抗艾滋病药物-奈韦拉平、抗抑郁药物-米氮平、非甾体消炎镇痛药-尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等的重要中间体。由于2-氯烟酸在农药和医药中的广泛应用，其市场需求日益增长。目前，2-氯烟酸的生产方法主要为化学合成法。如以烟酸为起始原料经氮氧化、氯化和水解合成2-氯烟酸；以3-氰基吡啶为原料，经氮氧化、氯化、水解合成2-氯烟酸；2-氯-3-甲基吡啶氧化法；以氰基乙酸乙酯为起始原料的成环法；以2-氯-3-三氟甲基吡啶为起始原料的氯化水解法。自瑞士Lonza公司于1977年申请了2-氯烟酸合成专利后(US4144238)，日本有机合成和日本光荣化学等化工巨头先后投身于2-氯烟酸的合成研究(JP59144759；JP56169672)。目前工业上主要采用3-氰基吡啶法生产2-氯烟酸，但其生产工艺存在污染重、合成步骤冗长、收率低等缺陷。酰胺酶是一类催化酰胺化合物合成相应羧酸的水解酶。因其高立体选择性、广底物谱等优势，以酰胺酶为生物催化剂的(手性)羧酸、(手性)酰胺衍生物及光学纯氨基酸的生物合成日益受到研究者的重视。酰胺酶法水解2-氯烟酰胺已成为合成2-氯烟酸的重要方法(CN101857889；BioorganicChemistry,2018,76:81-87)。蛋白质工程和晶体结构解析等技术的发展为酶分子改造提供了强有力工具。在已报道的酰胺酶中，郑仁朝等构建的泛生菌来源酰胺酶Pa-Ami突变体G175A可高效催化2-氯烟酰胺合成2-氯烟酸(CN201710974605.4)。构建高催化活力的酰胺酶生物催化剂对于实现2-氯烟酸的高效、绿色生产具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过定点饱和突变技术对泛生菌来源(Pantoeasp.)酰胺酶Pa-Ami突变体G175A进行进一步分子改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸制备中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术在泛生菌来源酰胺酶Pa-Ami突变体G175A(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示)基础上，利用半理性设计方法进一步获得酶活提高的突变体。所述酰胺酶突变体由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。具体的，所述的单位点突变为：将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸(A)替换为缬氨酸(V)或苏氨酸(T)；或将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第402位的缬氨酸(V)替换为亮氨酸(L)；或将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第403位的亮氨酸(L)替换为缬氨酸(V)或苏氨酸(T)。所述多位点突变为上述单位点突变的组合。作为优选，所述酰胺酶突变体为：SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸。相较于亲本酰胺酶Pa-Ami突变体G175A，上述酰胺酶突变体的活力大幅提升，均适应30～55℃的催化温度。本专利技术还提供了一种编码所述的酰胺酶突变体的编码基因以及包含所述编码基因的重组基因工程菌。作为优选，所述编码基因克隆至表达载体pET28b，转化至宿主细胞大肠杆菌EscherichiacoliBL21获得重组基因工程菌。本专利技术的另一个目的是提供所述的酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用。所述的应用包括：以包含酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。本专利技术所述的酰胺酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，还可以是经部分纯化或完全纯化的酶蛋白形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本专利技术的酰胺酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式进行使用。反应体系中，底物的初始浓度为50～300mM，每隔10～60min进行补料至终浓度50～200mM。催化剂的用量以菌体干重计为0.25～2.5g/L。作为优选，底物的初始浓度为200mM，每当底物残留低于20％时，补加终浓度100mM的2-氯烟酰胺。催化剂的用量以菌体质量(细胞干重)计，终浓度为2.5g/L反应体系。作为优选，反应介质为pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，反应条件为40℃，200r/min。本专利技术所述湿菌体按如下方法制备：将含酰胺酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、150r/min培养12h，随后以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(优选0.1mM)，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH值为7.0；LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂15，溶剂为去离子水，pH值为7.0。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供的酰胺酶突变体较亲本活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本专利技术的酰胺酶突变体能够适应30～55℃的催化温度，为工业化酶法生产2-氯烟酸奠定了基础。附图说明图1为G175A和三重突变体A378V/V402L/L403V全细胞催化2-氯烟酰胺(初始浓度为200mM)制备2-氯烟酸的补料反应进程。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。具体实施例中采用的亲本酰胺酶为本课题组前期构建的泛生菌(Pantoeasp.)来源酰胺酶Pa-Ami(GenBankNO.WP008109374)突变体G175A，并公开于中国专利申请文献(CN201710974605.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酰胺酶突变体，其特征在于，所述酰胺酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种酰胺酶突变体，其特征在于，所述酰胺酶突变体由SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。


2.如权利要求1所述的酰胺酶突变体，其特征在于，所述酰胺酶突变体为SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位丙氨酸突变成缬氨酸或苏氨酸、或第402位的缬氨酸突变成亮氨酸、或第403位的亮氨酸突变成缬氨酸或苏氨酸。


3.如权利要求1所述的酰胺酶突变体，其特征在于，所述酰胺酶突变体为SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸。


4.一种编码如权利要求1所述的酰胺酶突变体的编码基因。...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，刘长丰，吴哲明，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33