青霉素G酰化酶制造技术

本发明专利技术提供了工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包含该酶的组合物以及使用该工程化PGA酶的方法。

penicillin G-acylase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】青霉素G酰化酶本申请要求2017年6月27日提交的美国临时专利申请序列号62/525,404和2017年6月30日提交的美国临时专利申请序列号62/527,199的优先权，为了所有目的，它们在此被通过引用整体并入。专利
本专利技术提供了工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包含该酶的组合物以及使用该工程化PGA酶的方法。对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件与说明书一起经由EFS-Web同时提交，具有文件名“CX2-163USP1_ST25.txt”，创建日期2017年6月26日，且大小为424千字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且被通过引用以其整体并入本文。专利技术背景青霉素G酰化酶(PGA)(青霉素酰胺酶，EC3.5.1.11)催化青霉素G(苄基青霉素)侧链的酰胺键的裂解。该酶在商业上被用于制造6-氨基-青霉烷酸(6-APA)和苯基乙酸(PAA)。6-APA是工业生产半合成的β-内酰胺抗生素诸如阿莫西林、氨苄青霉素和头孢氨苄的关键化合物。天然存在的PGA酶在商业方法中显示出不稳定性，需要固定在固体基底上以便于商业化应用。PGA已经被共价结合至各种支持物，并且PGA固定化系统已经被报道为用于合成纯的光学异构体的有用工具。然而，附接到固体表面导致酶特性受损，诸如降低的活性和/或选择性以及对溶质接触的限制。此外，尽管附接到固体基底允许捕获酶并在另外的加工循环中再使用，但酶的稳定性使得此类应用可能受到限制。PGA对青霉素G的酶促催化形成6-APA是区域专一性(regiospecific)(它不裂解内酰胺的酰胺键)和立体特异性的。生产6-APA可能构成药物生产中对酶促催化的最大利用。PGA与苯乙酰基部分相关的酶活性允许立体特异性地水解伯胺以及醇的多种苯乙酰基衍生物。专利技术概述本专利技术提供了工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包含该酶的组合物以及使用该工程化PGA酶的方法。本专利技术提供了能够去除胰岛素二聚体的A1/B1/A1'/B1'-四-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶与SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多地相同。在一些实施方案中，本专利技术提供了能够去除胰岛素二聚体的A1/B1/A1'/B1'-四-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶与SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同。在一些另外的实施方案中，本专利技术提供了能够去除胰岛素的A1/B1/A1'/B1'-四-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶包含SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88。在一些另外的实施方案中，青霉素G酰化酶包含至少一个如表6.1、7.1、8.1、8.2、9.1、10.1和/或11.1中提供的突变。本专利技术提供了能够去除胰岛素二聚体的A1/A1'-二-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶与SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多地相同。在一些实施方案中，本专利技术提供了能够去除胰岛素二聚体的A1/A1'-二-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶与SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同。在一些另外的实施方案中，本专利技术提供了能够去除胰岛素的A1/B1/A1'/B1'-二-乙酸苯酯保护基团以产生游离胰岛素二聚体的工程化青霉素G酰化酶，其中该青霉素G酰化酶包含SEQIDNO:2、4、6、8、34、46、54、74和/或88。在一些另外的实施方案中，青霉素G酰化酶包含至少一个如表6.1、7.1、8.1、8.2、9.1、10.1和/或11.1中提供的突变。本专利技术还提供了工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的位置处的至少一个取代：54、62、115、125、127、127、185、253、254、254/255、254/255/370、255、256、257、257、260、268、322、325、348、369、370、372、373、377、378、384、384/513/536、388、389、391、435、461、517、530、554、556、557、559、560、600/623、623、624、626、627、705、706、707、723、740、748和752，其中所述位置参考SEQIDNO:6来编号。在一些实施方案中，该工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且具有选自以下的一个或更多个取代：54C、62G、115A/P、125L/T、127S/V、185V、253K/V、254T、254W/255G、254W/255G/370I、255L、255M/Q/T/Y、256Q、257I、257V、260A/P、268S/V、322P、325G、348C、348Q、369L、369P、369V、369W、370F/G/S、372A/H/L、373F/M、377P、378H、384A、384F/513Q/536M、384G/L、388T、389L、391P/S、435R、461A、517L/P、530C/Y、554A/E/P/V、556G、557G/S、559P/S、560I、600T/623V、623A/G/R/W、624A、626G、627G/H、705G/P、706G、707S、723A/G、740L、748G和752E。在一些另外的实施方案中，该工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且具有选自以下的一个或更多个取代：G54C、T62G、T115A/P、N125L/T、I127S/V、N185V、L253K/V、F254本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQ ID NO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的位置处的至少一个取代：54、62、115、125、127、127、185、253、254、254/255、254/255/370、255、256、257、257、260、268、322、325、348、369、370、372、373、377、378、384、384/513/536、388、389、391、435、461、517、530、554、556、557、559、560、600/623、623、624、626、627、705、706、707、723、740、748和752，其中所述位置参考SEQ ID NO:6来编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170627 US 62/525,404;20170630 US 62/527,1991.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:6具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的位置处的至少一个取代：54、62、115、125、127、127、185、253、254、254/255、254/255/370、255、256、257、257、260、268、322、325、348、369、370、372、373、377、378、384、384/513/536、388、389、391、435、461、517、530、554、556、557、559、560、600/623、623、624、626、627、705、706、707、723、740、748和752，其中所述位置参考SEQIDNO:6来编号。


2.如权利要求1所述的工程化青霉素G酰化酶变体，其中所述工程化青霉素酰化酶变体与SEQIDNO:6具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下的至少一个取代：54C、62G、115A/P、125L/T、127S/V、185V、253K/V、254T、254W/255G、254W/255G/370I、255L、255M/Q/T/Y、256Q、257I、257V、260A/P、268S/V、322P、325G、348C、348Q、369L、369P、369V、369W、370F/G/S、372A/H/L、373F/M、377P、378H、384A、384F/513Q/536M、384G/L、388T、389L、391P/S、435R、461A、517L/P、530C/Y、554A/E/P/V、556G、557G/S、559P/S、560I、600T/623V、623A/G/R/W、624A、626G、627G/H、705G/P、706G、707S、723A/G、740L、748G和752E。


3.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:8具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的至少一个取代集：103/370/444/706/766、103/369/370/442/444/536/556/766、103/369/370/444、103/369/370/444/556/706/766、103/369/370/444/765/766、103/369/370/765/766、257/362/384/451、257/362/384/451/723、362/451/705、369/370、369/370/444/706/766、369/370/556/766、369/370/388/444/556/766、369/370/444、369/370/444/556/766、369/370/556、369/370/556/765、369/370/556/766、369/370/766、369/370/444/556、369/370/444/556/612/766、369/370/444/556/706/765、369/370/444/706/765/766、372/373/384/513/560、372/384/451/705、372/384/560/705、384/451/560/705/723、384/451/705/723、451/560/705/723和451/705/723，其中所述位置参考SEQIDNO:8来编号。


4.如权利要求3所述的工程化青霉素G酰化酶变体，其中所述取代集选自103V/370F/444S/706G/766G、103V/369W/370F/442I/444S/536M/556G/766G、103V/369W/370F/444S、103V/369W/370F/444S/556G/706G/766G、103V/369W/370F/444S/765P/766G、103V/369W/370F/765P/766G、257V/362V/384A/451R、257V/362V/384L/451R/723L、362V/451R/705D、369P/370F、369P/370F/444S/706G/766G、369P/370F/556G/766G、369V/370F/388T/444S/556G/766G、369V/370F/444S、369V/370F/444S/556G/766G、369V/370F/556G、369V/370F/556G/765P、369V/370F/556G/766G、369V/370F/766G、369W/370F/444S/556G、369W/370F/444S/556G/612A/766G、369W/370F/444S/556G/706G/765P、369W/370F/444S/706G/765P/766G、372A/373M/384L/513Q/560G、372A/384L/451R/705D、372A/384L/560G/705D、384A/451R/560G/705D/723L、384L/451R/705D/723L、451R/560G/705D/723L和451R/705D/723L。


5.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:34具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的位置处的至少一个取代或取代集：55、275、403、482、496、541、616、619/664、622、639、664、747和759，其中所述位置参考SEQIDNO:34来编号。


6.如权利要求5所述的工程化青霉素G酰化酶变体，其中所述至少一个取代或取代集选自55V、275E、403T、482A/S、496K、541A、616G、619N/664G、622R、639G、664G、747G和759N。


7.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:34具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下的至少一个取代集：103/372/373/557、253/322/369/623、253/254/322/369/623、253/254/369/391/623/723、253/254/369/619/623/723、253/254/369/623/723、253/254/373/623/723、253/254/255/369/623/723、253/254/369、253/322/369/373/723、253/369/623/723、253/373/623、253/254/255/322/369/619/723、260/372/373/556、260/372/373/556/557/559、322/369、322/369/373/723、322/369/623/723和369/373/556，其中所述位置参考SEQIDNO:34来编号。


8.如权利要求7所述的工程化青霉素G酰化酶变体，其中所述取代集选自103V/372S/373F/557G、253H/322T/369W/623G、253H/254Q/322T/369W/623G、253H/254Q/369W/391A/623G/723A、253H/254Q/369W/619R/623G/723A、253H/254Q/369W/623G/723A、253H/254Q/373L/623G/723A、253H/254S/255V/369W/623S/723A、253H/254S/369W、253H/322T/369W/373W/723A、253H/369W/623G/723A、253H/373L/623S、253S/254S/255V/322T/369W/619R/723A、260S/372S/373F/556G、260S/372S/373F/556G/557V/559S、322T/369W、322T/369W/373W/723A、322T/369W/623G/723A和369W/373F/556G。


9.一种工程化青霉素G酰化酶变体，所述工程化青霉素G酰化酶变体与SEQIDNO:46具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且具有选自以下位置的位置处的至少一个取代或取代集：9/25/103/253/348/444/557/623、9/103/322/391/444/557/623、9/103/253/322/348/444/556/557/623、25/103/241/253/322/348/444/556/557/623、28、71、77、103/257/260/322/348/384/444/556/623、103/257/260/322/348/444/557、103/322/348/373/444/556/557、103/260/322/348/444/556/557/623、103/260/322/348/444/623、103/260/322/348/373/391/444/556/557/623、111、128、129、131、146/309/556/619/748、176/233/373/619/664、176/373/482/569、176/373/482/622/664、176/373/482/622、176/373/482/569/622/623/764、176/482、225/304/309/556/557/619/748、225/304/322/494/496/616/619/664/747/756、225/304/494/616/619/664/747/759、233/275/482/569/664、233/275/482/619、233/373/482/622/664、304/496/616/619/664/747/756/759、322/348/373/391/444/556/623、322/348/444/557、369、369/764、370、373/482/569/619/764S、373、379D、380、389、451、471、482/623、494/496/616/619/664、616、617、619、622、626和705，其中所述位置参考SEQIDNO:46来编号。


10.如权利要求9所述的工程化青霉素G酰化酶，其中所述至少一个取代或取代集选自9K/25V/103V/253S/348A/444S/557G/623D、9K/103V/322T/391A/444S/557G/623D、9K/103V/253S/322T/348A/444S/556G/557G/623D、25V/103V/241K/253S/322T/348A/444S/556G/557G/623D、28A/C/Q/S、A71C/F/G,L、77T/V、103V/257V/260S/322T/348A/384T/444S/556G/623D、103V/257V/260S/322T/348A/444S/557G、103V/322T/348A/373A/444S/556G/557G、103V/260S、322T/348A/444S/556G/557G/623D、103V/260S/322T/348A/444S/623D、103V/260S/322T/348A/373A/391A/444S/556G/557G/623D、111S、128H、129E、131D、146M/309D/556N/619S/748A、176S/233E/373A/619N/664R、176S...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉玛·沃兰德里，克里斯多佛·迈克尔·米克李斯奇，奥斯卡·阿尔维左，约瓦娜·纳佐尔，段达，朱迪·维多利亚·安东尼奥·维杜雅，斯蒂芬·詹纳，安驰慧，基思·艾伦·卡纳达，保罗·N·迪瓦恩，伊曼·法拉萨特，安娜·弗里斯科瓦斯卡，卡特里娜·W·莱克萨，罗伯特·凯文·奥尔，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US