本发明专利技术提供了一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。本发明专利技术人分离获得一种新颖的几丁质脱乙酰酶，其不仅能够催化几丁质的脱乙酰化，还能够有效地抑制病原菌。本发明专利技术的几丁质脱乙酰酶对于低温的适应性好，既能够在原核表达的条件下被表达，又具有较高低温活性的特性。同时，本发明专利技术还优化了该低温几丁质脱乙酰酶的重组表达方法，从而使之在宿主细胞中得到了高效的表达。
A recombinant chitin deacetylase and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用
本专利技术属于微生物学、分子生物学、生物化学领域，更具体地，本专利技术涉及一种低温几丁质脱乙酰酶的重组异源表达、制备及其应用研究；本专利技术的低温重组几丁质脱乙酰酶主要应用于医药、食品、农业等行业。
技术介绍
几丁质(Chitin)是由β-N-乙酰-D-葡萄糖胺单体通过β-1,4糖苷键连接成的直链多糖，壳聚糖是几丁质脱N-乙酰基的产物，一般地，N-脱乙酰度在55％以上的就可称之为壳聚糖。壳聚糖与几丁质的区别主要在于它们的聚合度、乙酰化度、乙酰化模式等特征不同，壳聚糖的溶解性比几丁质的溶解性高。壳聚糖分子中的氢离子被氢化使其无法形成氢键，导致壳多糖的化学性质相对几丁质要活泼很多，壳聚糖很容易发生乙酰化、烷基化、甲基化、酯化、醚化等化学反应。近年来，由几丁质制备的壳聚糖有许多独特的生物学活性逐渐引起了科学界和产业界的重视。目前，壳聚糖主要应用于食品、医药、环保等领域，随着研究的深入，其应用范围也在不断的扩展。工业上在生产壳聚糖的过程中，由于大部分采用热碱法，不仅具有生产成本高，产物均一性差，反应进程不易控制等缺点，而且在生产的过程中还会产生碱性废液污染环境。因此，工业上制备壳聚糖的高能耗和环境污染问题是亟待解决的。几丁质脱乙酰酶(Chitindeacetylases，CDAs)是酶法催化几丁质制备壳聚糖的一种酶种，其通过催化β-N-乙酰-D-葡萄糖胺脱乙酰基即可实现几丁质转化为壳聚糖。此外，一些几丁质脱乙酰酶还具有一定的抗真菌活性，可作为新型杀虫剂和抗真菌剂应用于现代农业。尽管现在已有人员针对以几丁质脱乙酰酶制取壳聚糖进行研究，但是，现有技术中存在的几丁质脱乙酰酶在生理生化性质、生物学功能等方面参差不齐，酶活性、底物特异性方面也良莠不齐，并且普遍存在低温下活性低的问题。因此，本领域亟待找到新型的，具有低温及高活性的几丁质脱乙酰酶，以提高此类酶的工业化生产水平、拓展其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：(a)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列多肽；(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或(c)与(a)所述的多肽的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性，且具有多肽(a)功能的多肽；(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。在一个优选例中，所述的多肽具有较高的低温活性；较佳地，其最适反应温度为15℃；较佳地，其在例如5℃时仍然具有65％以上的催化活性。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(1)编码如所述多肽的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的整合包括定向整合或随机整合。在另一优选例中，所述的细胞不是植物繁殖细胞或动物干细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞，如但不限于大肠杆菌。在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，包括：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的多肽。较佳地，在以下条件下进行培养：诱导剂IPTG(当宿主细胞为大肠杆菌时)浓度0.05～0.3mM、较佳地0.08～0.15mM；诱导温度16～35℃、更佳地18～30℃；更佳地18～20℃；诱导时间15～20小时；较佳地16～18小时。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：催化几丁质的脱乙酰化，或用于制备催化几丁质的脱乙酰化的组合物；较佳地，脱乙酰化后生成壳聚糖。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于：抑制微生物，或用于制备具有抑制微生物功能的组合物；较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。在本专利技术的另一方面，提供一种组合物，其包含：所述的多肽或所述的宿主细胞；以及工业学或微生物学上可接受的载体。在一个优选例中，所述的组合物为农药组合物，用于植物病害防治，较佳地用于防治棉花黄萎病和黄瓜枯萎病等。在本专利技术的另一方面，提供一种催化几丁质的脱乙酰化的方法，包括：应用所述的多肽、所述的宿主细胞或所述的组合物对几丁质或含有几丁质的物质进行处理；较佳地，脱乙酰化后生成壳聚糖。在本专利技术的另一方面，提供一种抑制微生物的方法，包括：应用权所述的多肽、所述的宿主细胞或所述的组合物对需要抑制微生物的对象(如含有微生物的场所、物质、动植物或其加工产物)进行处理；较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。在一个优选例中，在温度0～35℃、较佳地5～25℃、更佳地10～20℃(如12、14、15、16、18℃)条件下进行处理。在另一优选例中，在pH5～10、较佳地pH5.5～9、更佳地pH6.5～8.5(如pH7，7.5，8)条件下进行处理。在另一优选例中，在NaCl0.01～0.5M、较佳地0.03～0.3M、更佳地0.05～0.2M(如0.06、0.08、0.1、0.12、0.15M)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有Na+、K+、Mg2+、Zn2+和/或Ni2+(金属离子含量如1±0.8mM，较佳地1±0.5mM；更佳地1±0.3mM)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有EDTA(用量如为1±0.5％)条件下进行处理。在另一优选例中，在含有DTT(用量如为1±0.5％)条件下进行处理。在另一优选例中，进行所述处理时，反应体系中不含有：Li+、NH4+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、SDS和/或TritonX-100。在另一优选例中，进行所述处理时，反应体系中不含有：丙酮、乙醇、甲醇和/或乙腈。在另一优选例中，所述的微生物包括：真菌；较佳地所述真菌包括：轮枝菌属(Verticillium)真菌，镰刀菌属(Fusarium)真菌，曲霉属(Aspergillus)真菌，青霉属(Penicillium)真菌。更佳地，所述轮枝菌属真菌包括(但不限于)：大丽花轮枝孢(Verticilliumdahlia)；所述镰刀菌属真菌包括(但不限于)：尖孢镰孢黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)；所述曲霉属真菌包括(但不限于)：黑曲霉(Aspergillusniger)；所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：/n(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列多肽；/n(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或/n(c)与(a)所述的多肽的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有多肽(a)功能的多肽；/n(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。/n
【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：
(a)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列多肽；
(b)由(a)所述的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有多肽(a)功能的多肽；或
(c)与(a)所述的多肽的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有多肽(a)功能的多肽；
(d)在(a)或(b)或(c)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：
(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；
(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸；
较佳地，该多核苷酸编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；较佳地，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，包括：(i)培养权利要求4所述的宿主细胞；(ii)收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；(iii)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽；
较佳地，在以下条件下进行培养：
诱导剂IPTG浓度0.05～0.3mM、较佳地0.08～0.15mM；
诱导温度16～35℃、更佳地18～30℃；更佳地18～20℃；
诱导时间15～20小时；较佳地16～18小时。
6.权利要求1所述的多肽的用途，用于：
催化几丁质的脱乙酰化，或用于制备催化几丁质的脱乙酰化的组合物；较佳地，脱乙酰化后生成壳聚糖；或
抑制微生物，或用于制备具有抑制微生物功能的组合物；较佳地，所述的微生物是细胞壁包含几丁质的微生物。
7.一种组合物，其包含选自下组的成分：权利要求1所述的多肽；或权利要求5所述的宿主细胞；以及...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁海涛，陈波，俞勇，刘克振，
申请(专利权)人：中国极地研究中心中国极地研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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