一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种耐热N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。本发明专利技术的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶是如下a)或b)或c)：a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；b)如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明专利技术进一步涉及此类蛋白质在氨基葡萄糖制备中的应用。本发明专利技术还涉及与耐热N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶相关的生物材料。本发明专利技术所述脱乙酰酶可催化N‑乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰反应，应用于工业化制备氨基葡萄糖，其反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，具有较好的工业应用前景。

A thermostable N-acetylglucosamine deacetylase and its coding gene and Application

The invention provides a heat-resistant N-acetylglucosamine deacetylase, a coding gene and an application thereof. The N-acetylglucosamine deacetylase of the invention is a) or b) or C) as follows: a) a protein encoded by an amino acid sequence as shown in SEQ ID No.2; b) a fusion protein obtained by connecting N-terminal and / or C-terminal tags of a protein as shown in SEQ ID No.2; c) an amino acid sequence as shown in SEQ ID No.2 is replaced and / or missing and / or added by one or more amino acid residues and Proteins with the same function. The invention further relates to the application of such proteins in the preparation of glucosamine. The invention also relates to a biomaterial related to a thermostable N-acetylglucosamine deacetylase. The deacetylase of the invention can catalyze the deacetylation of N-acetylglucosamine, and is applied to the industrial preparation of glucosamine. The reaction conditions are mild, the energy consumption is small, and no pollutants are produced, so the invention has a good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。
技术介绍
氨基葡萄糖(C6H13NO5)又称葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，是葡萄糖2位的羟基被氨基取代后形成的氨基单糖。氨基葡萄糖是自然界含量最丰富的单糖之一，在于人体中多存在于关节软骨、结缔组织和细胞膜中。氨基葡萄糖也是生物体蛋白质或脂类糖基化反应中的重要前体，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。氨基葡萄糖是一种重要的功能食品，也是一种辅助治疗药物，其主要可以舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀；舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀；润滑关节及维持关节功能。此外，氨基葡萄糖在体内可以参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡也有良好的疗效。氨基葡萄糖还有吸收自由基、抗衰老、减肥、调节内分泌等多种有益的生理作用，已广泛应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。氨基葡萄糖的制备方法主要有化学合成法、酸水解法、微生物发酵法和生物转化法。目前，氨基葡萄糖工业制备方法主要为甲壳素水解法和微生物发酵法。甲壳素水解法生产氨基葡萄糖主要利用酸水解甲壳素获得单糖，大量酸、碱的使用对环境造成严重污染，此外，由于甲壳素原料依赖海洋甲壳质资源，其应用受到极大制约。微生物发酵法具有诸多优点，如原料来源不受限制，无致敏性、环境污染影响较小等，是目前工业制备氨基葡萄糖的发展趋势。但由于发酵过程中微生物对氨基葡萄糖耐受性有限，发酵法生产的氨基葡萄糖一般以N-乙酰氨基葡萄糖形式存在，后续还需进一步脱乙酰得到最终的氨基葡萄糖产品。目前N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰普遍采用盐酸水解法，即使用浓盐酸高温水解N-乙酰氨基葡萄糖，脱去乙酰基后生成氨基葡萄糖。盐酸水解法生产周期较长，产生大量的废酸及副产物，对氨基葡萄糖产品质量及环保均造成负面影响。N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶能够专一催化N-乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰反应，其反应条件温和，操作简单，环境污染少，是最为理想的氨基葡萄糖脱乙酰制备方法。然而，由于酶稳定性，催化活性，成本等原因，目前尚无商品化专一性制备氨基葡萄糖的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，工业上目前也尚未大规模采用酶法脱乙酰制备氨基葡萄糖。目前已公开的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶也多为常温酶，催化转化率不高，限制了酶法脱乙酰的应用。目前已公开的可应用于N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰反应的特异性脱乙酰酶报道较少，仅少量微生物来源的脱乙酰酶具有类似活性，如中国专利CN107022538A公开的一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因。发掘具有较高活性的耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，通过基因重组的方法，构建基因工程菌，高效异源表达N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，探索N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶制备氨基葡萄糖的酶解工艺，具有重要的工业应用价值和潜力。
技术实现思路
本专利技术的目是提供一种耐热N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为TcDac，a)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；b)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。其中，如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。为了使上述蛋白质便于纯化，可在SEQIDNO.2所示氨基酸序列第1-266位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a)-c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a)-c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNO.1所示第1-798位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。本专利技术的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。本专利技术提供的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。其中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；4)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。B4)中所述的重组菌是将上述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌。上述重组菌中，所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌；上述重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码TcDac的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TcDac的核苷酸序列85％或者更高相似性的核苷酸，只要编码TcDac且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其特征在于，是如下a)或b)或c)的蛋白质：/na)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；/nb)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nc)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；
b)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。


2.根据权利要求1所述一种蛋白质，其特征在于，如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-266位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：
与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。


3.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，为下述B1)-B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵黎明，秦臻，马佳菲，邱勇隽，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31