稳定的多特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及多特异性抗体构建体，其包含在CH1和CL结构域的界面处具有特定突变组的Fab片段，所述突变防止重链/轻链错配。

Stable multi-specific antibody

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的多特异性抗体本专利技术涉及在医学领域中有用的多特异性抗体分子的生产。专利技术背景双特异性抗体(bsAb)结合了两种抗体的特异性，并同时针对不同的抗原或表位。具有“两个靶标”功能的BsAb可以干扰例如与癌症，增殖或炎症过程相关的多种表面受体或配体。BsAb还可将靶标紧密相邻，以支持一个细胞上蛋白质复合物的形成，或触发细胞之间的接触。“强制连接”功能的实例是支持凝血级联中蛋白质络合的bsAb，或靶向肿瘤的免疫细胞募集者和/或激活剂。经过多年的研究和开发，第一个bsAb于2009年获得批准。最初，双特异性抗体是通过化学缀合或通过使用产生两种不同mAb的两种杂交瘤细胞系之间融合产生的四交瘤(quadromas)制备的。然而，化学缀合有时可能会改变抗原结合位点，从而导致抗体的生物学特性受损。四交瘤方法具有这样的缺点，即来自两种不同抗体的重链和轻链的随机配对在理论上产生十种同样可能的组合，从而产生免疫球蛋白分子的混合物，其中只有一种是所需的双特异性产物，必须将其与错误配对的产物分开。遗传改造现已成为生产双特异性抗体的首选方法，并已导致多种不同的重组双特异性抗体形式的开发。这些双特异性抗体中的一些非常简单，它们源自通过适当的肽接头连接的两种(或多种)不同抗体的单链Fv(scFv)片段。这些抗体相对容易生产，并且由于它们由一条多肽链形成并且仅包含亲本抗体的Fv区，因此在链之间不会出现错配的问题。然而，它们小于全长免疫球蛋白，并且没有恒定区，特别是Fc区。尽管在一些应用中可能是有利的，例如当希望避免Fc介导的效应时，但在需要Fc介导的效应功能时却是不利的。而且，由于它们的尺寸小并且缺乏Fc区，它们具有非常短的体内半衰期。因此，已经设计了其他双特异性重组抗体形式，其更接近地模拟天然存在的免疫球蛋白分子，特别是具有完整的Fc区。它们可以被分为两种主要形式。在第一种抗体(IgGscFv)中，来自抗体A的scFv片段与抗体B重链的末端(通常为C-末端)融合。所得抗体仅具有一种类型的重链(其包含抗体B的VH、CH1、CH2和CH3结构域以及抗体A的VH和VL结构域)，和一种类型的轻链(其包含抗体B的VL和CL结构域)，不会发生链之间的错配。例如Qu等人(Blood,111,2211-2219,2008)描述了这种形式。在第二种抗体中，抗体A的重链和轻链与抗体B的重链和轻链配对。这种形式再生了四交瘤产生的双特异性抗体，因此也产生了类似的错配问题。为了解决重链错配对的问题，已经提出了使抗体的CH3结构域突变以促进其异二聚化(即，重链A与重链B配对)并防止其同二聚化。这是通过所谓的“旋钮进入孔(knobintoholes)”方法来完成的(Ridgway等人，ProteinEng，9，617-21，1996；美国专利7,695,936)。在抗体A的重链的CH3二聚体界面处引入了“旋钮”突变，该突变由较小的氨基酸替换为较大的氨基酸组成，产生空间位阻，其阻止了同二聚化。同时，为了促进异二聚化，将由大氨基酸被较小氨基酸替换组成的互补“孔”突变引入抗体B的CH3结构域。为了解决重链/轻链错配的问题，已经建议使用不同特异性但共享共同轻链的抗体，该抗体先前已从scFv噬菌体文库中鉴定出来(Merchant等人，NatBiotechnol,16,677-81,1998；美国专利7,183,076)。该方法的缺点是难以鉴定具有共同轻链的抗体。国际专利申请WO2013/005194提出，可以通过使CH1和CL结构域的界面处的一些关键残基突变来防止重链/轻链错配，并因此确保链的期望配对。专利技术概述本专利技术人现已发现，一组新的突变可以进一步改善多特异性抗体分子中链的匹配。本专利技术涉及多特异性，例如双特异性抗体构建体，其包含在CH1和CL结构域的界面处具有特定组突变的不同Fab片段，所述突变促进重链/轻链的同源配对并防止其错配。本文中用于CH1和CL结构域的序列位置编号是指Kabat编号(Kabat，EA等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版-USDepartmentofHealthandHumanServices，NIH出版物，第91-3242号，第662,680,689页，1991年)。本文提供选自以下的突变的Fab片段：a)Fab片段，其由以下组成：-目的抗体的VH和VL结构域；-通过CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域，和-通过CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域；和b)Fab片段，其由以下组成：-目的抗体的VH和VL结构域；-通过CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域；和-通过CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域。包含这种突变的Fab片段的任何构建体，优选任何蛋白质构建体，都是本专利技术的一部分。特别地，提供了多特异性抗原结合片段，其包含具有不同的CH1和CL结构域的至少两个Fab片段，其中每个Fab片段识别不同的目的表位，并且所述Fab片段以任何顺序串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C-末端通过多肽接头与随后的Fab片段的VH结构域的N-末端连接，其中至少一个Fab片段，更优选两个片段选自：a)Fab片段，其由以下组成通过CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域，和-通过CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域；和b)Fab片段，其由以下组成：-目的抗体的VH和VL结构域；-通过CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域；和-通过CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域。根据优选的实施方案，CH1结构域衍生自IgG免疫球蛋白，有利地为IgG1亚型。CL结构域优选是κ型。优选地，用于人类治疗时，从中衍生出突变的CH1和突变的CL结构域的免疫球蛋白是人类免疫球蛋白。VH和VL结构域可衍生自任何天然或遗传改造的抗体，其识别人们希望靶向的表位。本专利技术的突变的Fab片段可用于其中需要促进重链/轻链的同源配对并防止其错配的任何多特异性抗体构建体中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质构建体，其包含选自以下的突变的Fab片段：/na)Fab片段，其由以下组成：/n-目的抗体的VH和VL结构域；/n-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，和/n-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域；和/nb)Fab片段，其由以下组成：/n-目的抗体的VH和VL结构域；/n-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域；和/n-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170327 EP 17305353.91.蛋白质构建体，其包含选自以下的突变的Fab片段：
a)Fab片段，其由以下组成：
-目的抗体的VH和VL结构域；
-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，和
-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域；和
b)Fab片段，其由以下组成：
-目的抗体的VH和VL结构域；
-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域；和
-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。


2.权利要求1的蛋白质构建体，其包含多特异性抗原结合片段或由多特异性抗原结合片段组成，所述多特异性抗原结合片段包含具有不同CH1和CL结构域的至少两个Fab片段，其中每个Fab片段识别不同的目的表位，并且所述Fab片段以任何顺序串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C-端末端通过多肽接头与随后的Fab片段的VH结构域的N-端末端连接，
其中至少一个Fab片段由如权利要求1所定义的突变的Fab片段组成，优选地，其中两个Fab片段是如权利要求1所定义的突变的Fab片段。


3.权利要求2的蛋白质构建体，其是具有两个相同抗原结合臂的多特异性抗体，每个臂由如权利要求2所定义的多特异性抗原结合片段组成。


4.权利要求3的蛋白质构建体，其具有免疫球蛋白样结构，包括：
-两个相同的抗原结合臂，每个臂由如权利要求1所定义的多特异性抗原结合片段组成；
-免疫球蛋白的二聚化的CH2和CH3结构域；
-IgA，IgG或IgD的铰链区，其连接所述抗原结合臂的CH1结构域的C-端末端和所述CH2结构域的N-端末端。


5.权利要求4的蛋白质构建体，其优选是双特异性抗体，并且包含至少两个重链和四个轻链，
其中每个重链包含
a.包含铰链-CH2-CH3结构域的免疫球蛋白的Fc区，
b.所述Fc区通过所述铰链结构域与抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH连接，
c.其继而通过多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH连接，并且多肽接头序列连接所述Ab1的Fab重链VH结构域的N-末端与所述Ab2的CH1结构域的C-末端，
并且四个轻链包含与它们的同源(cognate)重链结构域相关的Ab1的Fab轻链CL-VL和Ab2的Fab轻链CL-VL；
其中Ab1和Ab2识别不同的表位，
并且其中Ab1或Ab2之一的FabCH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域，和/或
其中Ab1或Ab2中一个或另一个的FabCH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。


6.权利要求5的蛋白质构建体，其中Ab1的所述FabCH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域，并且其中Ab2的所述FabCH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬...

【专利技术属性】
技术研发人员：E朱科夫斯基，O莱格尔，RJ莫尔斯，
申请(专利权)人：拜奥穆尼克斯制药，
类型：发明
国别省市：法国;FR