靶向EGFR和HER2的双特异性抗体制造技术

本公开涉及靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，以及用于生产这些抗体的方法。双特异性抗体由一个完整的抗体组成，所述抗体上两个VH‑VL链经由接头与抗体的两个VH链的每个NH端区域附接。构建的双特异性抗体使用两种分别靶向EGFR和HER2的单克隆抗体，即西妥昔单抗和曲妥珠单抗的重链(VH)和轻链(VL)可变区的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向EGFR和HER2的双特异性抗体本专利技术涉及靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，用于生产该抗体的方法，其组合物和用途。专利技术背景HER家族(其包括4种酪氨酸激酶受体(EGFR/HER1、HER2、HER3和HER4))激活参与细胞增殖的多重部分冗余互联下游信号级联反应(例如MAPK和PI3K/AKT途径)。已经在大量实体肿瘤(肺、结肠直肠、胰腺等)中观察到HER异常信号传导。EGFR和HER2是细胞表面受体酪氨酸激酶(TK)，其通过与HER家族受体的同源二聚化和异源二聚化来转导生长信号。与EGFR或HER2同源二聚化相比，EGFR与HER2的异源二聚体诱导更有效的TK信号传导的激活。当肿瘤细胞过表达EGFR和HER2两者时，由于EGFR/HER2异源二聚化和信号传导的潜力增加，它们表现出侵袭性肿瘤细胞生长。胰腺癌是表达EGFR和HER2受体的具有很差的预后的实体瘤的实例。在胰腺肿瘤中，EGFR在45-95％的胰腺癌中表达，并且表达通常与切除的胰腺癌中较差的结果相关。HER2的过表达也已经描述于7-58％的胰腺癌中，并且HER2-扩增的胰腺癌显示非典型的转移模式，表明HER2可能也是胰腺癌中肿瘤发生的重要驱动因素。此外，已报道大约四分之一的EGFR+胰腺癌也额外地是HER2+(Danceretal(2007)OncologyReports18,p.151)，使得它们具有双阳性EGFR+/HER2表型。胰腺癌是欧洲中癌症死亡的第四最常见的原因，每年病例数增加(男性中+2％，女性中+10％)。即使早期得到诊断，它的预后也很差。它是过去40年中生存率几乎没有得到改善的唯一癌症之一：1年和5年后生存率分别低于20％和5％。尽管胰腺癌在2012年导致全世界超过230,000人死亡，但由于缺乏有效的治疗方法，它仍然是一种罕见的疾病，死亡人数与新诊断的患者一样多。目前，胰腺腺癌(90％的胰腺癌)通过手术、化学疗法或放射和化学疗法的组合进行治疗，结果有限。在1996年作为一线治疗的吉西他滨的推出将无复发的中值生存期提高1.3个月，并且一年的总生存率(overallsurvival，OS)从2％提高至18％。自2005年以来，尽管进行了各种临床试验，仅两种药物，(厄洛替尼(erlotinib))和(白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel))已被批准用于胰腺癌，主要涉及组合但很少有创新。厄洛替尼作为第一个靶向疗法，与吉西他滨联合仅将无复发的中值生存期提高1个月。用直接靶向HER受体或下游激酶的治疗剂的方法的治疗通常面临获得性抗性或受信号转导网络的内在稳健性限制。在此类情况下，联合治疗已显露为自然对策，尽管它们的最佳设计并不简单并且可以取决于肿瘤或其亚型，因此需要事先的患者分层(FitzgeraldJB,SchoeberlB,NielsenUB,SorgerPK.Systemsbiologyandcombinationtherapyinthequestforclinicalefficacy.NatChemBiol.2006；2:458–66.)。目前可用于抑制HER信号传导的武器库由小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)例如拉帕替尼(lapatinib)或厄洛替尼，和治疗性抗体例如西妥昔单抗或曲妥珠单抗组成。抗体确实代表了一种强有力的方法，其在信号传导减少之上诱导免疫效应以帮助清除肿瘤，与限于信号传导调节的TKI形成对比。许多作者已经提出了基于抗体的联合疗法。通过mAb组合靶向HER二聚体，特别是EGFR/HER2异源二聚体被证明有利于抑制胰腺肿瘤生长。结合两种mAb的靶物的双特异性抗体(BsAb)已得到进一步设计。一些双特异性抗EGFR/抗HER2抗体已得到更具体的描述。然而，它们遭受通常导致较差的可制造性和稳定性的复杂的设计，并且这些抗体的功效仍然可以得到改善，因为在体内胰腺癌模型中，即使在用双特异性抗体治疗时，肿瘤也得以继续生长。例如，Liu及其同事(Liuetal.ANovelAntibodyEngineeringStrategyforMakingMonovalentBispecificHeterodimericIgGAntibodiesbyElectrostaticSteeringMechanism.JBiol.Chem.2015；290(12):7535-62)描述了双特异性抗EGFR和抗HER2抗体的构建和特性，其中分别利用了帕尼单抗(panitumumab)和曲妥珠单抗序列。该抗体在体外和体内表现出针对EGFR+/HER2+细胞系的改善的活性，然而该抗体的活性仍需要改善。Lewis及其同事(Lewisetal.GenerationofbispecificIgGantibodiesbystructure-baseddesignofanorthogonalFabinterface.NatureBiotechnology.2014；32；191–198)也描述了双特异性抗EGFR和抗HER2抗体，然而在这种情况下，分别使用了不同的抗体序列，马妥珠单抗(matuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)序列，以及不同的工程化设计。国际专利申请WO2014/001324报道了通过使用转肽酶(例如分选酶A(SortaseA))选择和生产多特异性实体的方法，以及该方法用于生成新的定制多特异性抗体的用途。示例了含有帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的双特异性抗体。国际专利申请WO2014/124326描述了含有例如曲妥珠单抗和西妥昔单抗的多特异性抗体构建体，以及多特异性抗体药物缀合物。双特异性HER2/EGFR抗体也描述于欧洲专利申请EP2727940中(其中抗体在重链中携带六个突变以实现异源二聚体配对)以及欧洲专利申请EP2035456中。然而，这些抗体的结构可以导致去稳定化和免疫原性。WangS等人(CancerLett2012Dec28；325(2):214-9)使用曲妥珠单抗和西妥昔单抗工程化改造了抗EGFR/HER2双特异性抗体。然而，与两种抗原的结合是单价的而不像在天然抗体中是二价的，因此可以尚未达到EGFR和HER2抑制的全部效力。鉴于上述情况，仍然需要用于治疗肿瘤的改善的双特异性抗体构建体。专利技术概述本专利技术人现设计了靶向EGFR和HER2的新型双特异性抗体，在多种癌症的治疗中有用。本专利技术更具体地提供了包含两条重链和四条轻链的双特异性抗体，其中每条重链包含a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，b.所述Fc区通过所述铰链域连接至抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH，c.其继而通过多肽接头序列连接至抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH域的N-末端与所述Ab2的CH1域的C-末端连接，并且所述四条轻链包含与其关联重链域结合的Ab1的Fab轻链和Ab2的Fab轻链；其中不同的Ab1和Ab2独立地选自由在一方面上西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物以及在另一方面上曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物组成的组。在第一实施方案中，Ab1为西妥昔单抗或其突变衍生物，并且Ab2为曲妥珠单抗或其突变衍生物。在另一个实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含两条重链和四条轻链的双特异性抗体，其中每条重链包含a.包含铰链‑CH2‑CH3域的免疫球蛋白的Fc区，b.所述Fc区通过所述铰链域连接至抗体1(Ab1)的Fab重链CH1‑VH，c.其继而通过多肽接头序列连接至抗体2(Ab2)的Fab重链CH1‑VH，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH域的N‑末端与所述Ab2的CH1域的C‑末端连接，并且所述四条轻链包含与它们的关联重链域结合的Ab1的Fab轻链和Ab2的Fab轻链；其中不同的Ab1和Ab2独立地选自由在一方面上西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物以及在另一方面上曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物组成的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.28 EP 16305496.81.包含两条重链和四条轻链的双特异性抗体，其中每条重链包含a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，b.所述Fc区通过所述铰链域连接至抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH，c.其继而通过多肽接头序列连接至抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH域的N-末端与所述Ab2的CH1域的C-末端连接，并且所述四条轻链包含与它们的关联重链域结合的Ab1的Fab轻链和Ab2的Fab轻链；其中不同的Ab1和Ab2独立地选自由在一方面上西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物以及在另一方面上曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物组成的组。2.权利要求1的双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为西妥昔单抗或其突变衍生物，包含οVH域，其包含SEQIDNO:4，优选由SEQIDNO:4组成，οCH1域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:22，οVL域，其包含SEQIDNO:13，优选由SEQIDNO:13组成，οCL域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQIDNO:11、SEQIDNO:14、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25，其中所述CH1和CL域如下结合-SEQIDNO:2与SEQIDNO:11，-SEQIDNO:5与SEQIDNO:14或SEQIDNO:23，-SEQIDNO:20与SEQIDNO:14或SEQIDNO:23，-SEQIDNO:21与SEQIDNO:24或SEQIDNO:25，-SEQIDNO:22与SEQIDNO:24或SEQIDNO:25。3.权利要求1的双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为曲妥珠单抗或其突变衍生物，包含οVH域，其包含序列SEQIDNO:1，优选由序列SEQIDNO:1组成，οCH1域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21和SEQIDNO:22，οVL域，其包含由序列SEQIDNO:10组成的序列，οCL域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQIDNO:11、SEQIDNO:14、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25，其中所述CH1和CL域如下结合-SEQIDNO:2与SEQIDNO:11，-SEQIDNO:5与SEQIDNO:14或SEQIDNO:23，-SEQIDNO:20与SEQIDNO:14或SEQIDNO:23，-SEQIDNO:21与SEQIDNO:24或SEQIDNO:25，-SEQIDNO:22与SEQIDNO:24或SEQIDNO:25。4.权利要求4或5中任一项的双特异性抗体，其中所述Ab1的CH1和CL域具有与所述Ab2的CH1和CL域不同的序列的组合。5.权利要求1至4中任一项的双特异性抗体，其中所述多肽接头序列包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:16或SEQIDNO:34，优选由SEQIDNO:3、SEQIDNO:16或SEQIDNO:34组成。6.权利要求1至5中任一项的双特异性抗体，其包含以下各项，优选由以下各项组成，a)两条重链，每条包含连续序列，优选由连续序列组成，所述连续序列以N至C端次序包含：·曲妥珠单抗重链VH，其包含SEQIDNO:1，优选由SEQIDNO:1组成，·CH1域，其包含SEQIDNO:2，优选由SEQIDNO:2组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：E朱科夫斯基，O莱杰，PE杰拉德，A佩雷格林，C拉宝勒特，
申请(专利权)人：拜奥穆尼克斯制药，国家健康与医学研究院，蒙彼利埃大学，法国蒙彼利埃癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：法国,FR