一株产L-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一株产L‑异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术利用基因工程手段强化了黄色短杆菌中乙酰羟基酸合酶、二羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶，并异源表达tdcB编码的分解代谢苏氨酸脱水酶，从而构建了一株L‑异亮氨酸高产菌株B.flavum I12/pEC‑XK99E‑ilvBNCE‑tdcB。该重组菌株积累异亮氨酸的产量提高到22.65g/L，比出发菌株提高了25.48％，最大生物量为达到20.95g DCW/L。此发明专利技术可将赖氨酸途经碳源转向L‑异亮氨酸，为构建L‑异亮氨酸高产菌株提供崭新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一株产L-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法
本专利技术涉及一株产L-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程

技术介绍
L-异亮氨酸，别名L-异白氨酸，是人体八种必需氨基酸之一。广泛应用于食品、饲料、化妆品与医药行业。因此，选育一株L-异亮氨酸产量高，代谢稳定的菌株，对生产具有重要作用。代谢工程为L-异亮氨酸生产提供了有效的改造途径，但是现有的通过代谢途径改造的L-异亮氨酸生产菌依然存在产量低的问题。L-异亮氨酸合成途径中第一关键限速酶是苏氨酸脱水酶，苏氨酸脱水酶又分为ilvA编码的合成代谢苏氨酸脱水酶和tdcB编码的分解代谢苏氨酸脱水酶，基因ilvA被广泛应用L-异亮氨酸产生菌的构建，但ilvA编码的合成代谢苏氨酸脱水酶收到L-异亮氨酸的反馈抑制，提高水平有限。由ilvBN编码乙酰羟基酸合成酶为异亮氨酸合成途径中第二限制酶，ilvBN基因催化2-酮丁酸和丙酮酸生成三种支链氨基酸。但是关键酶对生长代谢的影响较大，如何构建一株既能不影响生长，又能提高L-异亮氨酸产量的菌株，成为亟待研究的课题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术首次将来源于E.coliW3110中的tdcB异源表于产L-异亮氨酸的黄色短杆菌中。并通过提高ilvBNCE转录水平，提高L-异亮氨酸合成途径碳通量，以期提高L-异亮氨酸产量。本专利技术的目的是：解除L-异亮氨酸对合成途径关键酶的反馈抑制，并提高合成途径碳通量。构建一株L-异亮氨酸高产菌株，命名为：BrevibacteriumflavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB。本专利技术的第一个目的是提供一株产L-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌，所述重组菌异源表达了大肠杆菌来源的分解代谢苏氨酸脱水酶，且过表达了乙酰羟基酸合酶、二羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶。进一步地，所述的分解代谢苏氨酸脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。来源于大肠杆菌EscherichiacoliW3110。进一步地，所述的乙酰羟基酸合酶和二羟酸还原异构酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述的支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，所述的重组菌是以黄色短杆菌B.flavumI12为宿主。黄色短杆菌B.flavumI12根据《L-异亮氨酸高产菌选育及其培养基优化》王壮壮等，生物技术通报，2019，35(1)中记载。进一步地，所述的重组菌是以pEC-XK99E作为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供所述的黄色短杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将编码乙酰羟基酸合酶的基因ilvBN和编码二羟酸还原异构酶的基因ilvC与pEC-XK99E载体进行连接，构建质粒pEC-XK99E-ilvBNC；(2)将编码支链氨基酸转氨酶的基因ilvE与重组质粒pEC-XK99E-ilvBNC进行连接，构建质粒pEC-XK99E-ilvBNCE；(3)将编码分解代谢苏氨酸脱水酶的基因tdcB与重组质粒pEC-XK99E-ilvBNCE进行连接，构建质粒pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB；(4)将重组质粒pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB转化到黄色短杆菌B.flavumI12中，构建得到黄色短杆菌重组菌。本专利技术的第三个目的是提供所述的黄色短杆菌重组菌在发酵生产L-异亮氨酸中的应用。进一步地，所述的发酵是在28～32℃，转速80～100r/min，pH6.5～7.5条件下进行发酵。本专利技术的第四个目的是提供所述的黄色短杆菌重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。本专利技术的有益效果是：利用基因工程手段强化了黄色短杆菌中乙酰羟基酸合酶、二羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶，并异源表达tdcB编码的分解代谢苏氨酸脱水酶，从而构建了一株L-异亮氨酸高产菌株B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB。该重组菌株积累异亮氨酸的产量提高到22.65g/L，比出发菌株提高了25.48％，最大生物量为达到20.95gDCW/L。此专利技术可将赖氨酸途经碳源转向L-异亮氨酸，为构建L-异亮氨酸高产菌株提供崭新的思路。附图说明图1为重组质粒的酶切验证电泳图；泳道说明：M:DNAmarkerDL10000；1:pEC-XK99E-ilvBNC单酶切；2:pEC-XK99E-ilvBNC双酶切产物ilvBNCr；3:pEC-XK99E-ilvBNCE单酶切产物ilvE；4:pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB单酶切；5:pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB双酶切产物tdcB；图2为重组菌蛋白表达图，永道说明：M:ProteinLadder；1:B.flavumI12/pEC-XK99E；2:B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNC；3:B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE；4:B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB；图3为基因改造对L-异亮氨酸发酵的影响；A:B.flavumI12/pEC-XK99E；B：B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNC；C：B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE；D：B.flavumI12/pEC-XK99E-ilvBNCE-tdcB。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。L-异亮氨酸产量测定采用高效液相色谱法：取800μL发酵液，8000r/min离心3min去除菌体，经孔径0.22μm的滤膜过滤所得滤液，用高效液相色谱Agilent1200分析测定其中L-异亮氨酸含量。色谱柱：AgilentZORBAXEclipseAAA；检测器：DAD检测器；流动相：流动相A，5mL/L四氢呋喃，5g/L无水乙酸钠，200μg/L三乙胺，冰醋酸调pH至7.2；流动相B，25g/L无水乙酸钠：甲醇：乙腈＝1：2：2；色谱条件：柱温40℃，流速1.0mL/min，进样体积10.0μL，波长338nm。表1.PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)实施例1：重组表达载体pEC-XK99E-ilvBNC的构建根据NCBI中C.glutamicumATCC13032全基因组核酸序列中的ilvBNC基因序列，其中，ilvBNC基因序列是将ilvBN基因与ilvC基因连接得到，上游引物的5’端加入限制性内切酶SmaI，在基因下游加入XbaI酶切位点，合成上下游引物ilvBNC-F和ilvBNC-R，以C.glutamicumATCC13032全基因组为模板PCR获得基因ilvBNC基因片段，经胶回收试剂盒纯化后，将片段与质粒pEC-XK99E用相同的限制性内切酶酶切后，过夜酶连并转化入JM109感受态细胞，经过菌落PCR验证选取可能正确的菌落，提取质粒酶切电泳验证，得到正确目的条带后(7018和2322bp2个片段)，提交给通用生物系统(安徽)有限公司测序。pEC-XK99E-ilvBNC构建完成。实施例2：重组表达载体pEC-XK99E-ilvBNCE的构建根据NCBI中C.glutamicumATCC13本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产L‑异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，异源表达了大肠杆菌来源的分解代谢苏氨酸脱水酶，且过表达了乙酰羟基酸合酶、二羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶。

【技术特征摘要】
1.一株产L-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，异源表达了大肠杆菌来源的分解代谢苏氨酸脱水酶，且过表达了乙酰羟基酸合酶、二羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶。2.根据权利要求1所述的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，所述的分解代谢苏氨酸脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，所述的乙酰羟基酸合酶和二羟酸还原异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，所述的支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。5.根据权利要求1所述的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以黄色短杆菌B.flavumI12为宿主。6.根据权利要求1所述的黄色短杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以pEC-XK99E作为表达载体。7.一种权利要求1～6任一项所述的黄色短杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将编码乙酰羟基酸合...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟国，徐建中，王壮壮，魏佳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32