一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产L‑苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明专利技术是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为强启动子T7；敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，减少发酵过程苏氨酸的代谢消耗；替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，削弱赖氨酸的合成。最终得到积累L‑苏氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到30g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑苏氨酸奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
本专利技术涉及一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程

技术介绍
L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。广东肇庆星湖生物科技公司王焕章掣以大肠杆菌K12为出发菌株，利用Red重组敲除苏氨酸脱氨酶基因，筛选异亮氨酸营养缺陷型菌株，再过表达苏氨酸操纵子基因，成功构建大肠杆菌THR6，其发酵32h产L-苏氨酸可达75g/L。华东理工大学沈琼通过强化L-苏氨酸合成途径关键酶和L-苏氨酸分泌有关基因，构建基因工程菌EcoliVNBKB.3507，其发酵48h产L-苏氨酸52.7g/L。Lee等运用系统生物学方法从EcoliW3100(1acI-)出发，构建的工程菌株发酵50h产L一苏氨酸82.4g/L，糖酸转化率为39.3％。大肠杆菌(Escherichiacoli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。在本专利技术的一种实施方式中，是替换了高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。在本专利技术的一种实施方式中，高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。本专利技术的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：1)构建T7启动子替换重组片段、苏氨酸脱氢酶敲除片段以及二氢吡啶二羧酸合成酶起始密码子替换重组片段：将大肠杆菌高丝氨酸激酶编码基因thrB起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T71；将苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB上下游同源臂序列融合后，得到片段TD2；将二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子上下游同源臂序列进行融合后，将起始密码子ATG替换为GTG，得到片段DA3；2)构建重组质粒：分别将片段T71、TD2、DA3与含sgRNA的线性化载体PCR连接；分别得到含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含GA3的重组质粒；3)构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，得到重组大肠杆菌CICC20905-cas9；随后将含T71的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-cas9，得到重组大肠杆菌CICC20905-thrT；将含TD2的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-thrT，得到重组大肠杆菌CICC20905-tdcD；将含GA3的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-tdcD，确认dapA基因起始密码子被替换为GTG并去除重组质粒pTDA后得到thrB基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失且dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR，所述外源质粒包括含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含GA3的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。在本专利技术的一种实施方式中，所述含有sgRNA的线性化载体包括pTT7、pTTD或pTDA。在本专利技术的一种实施方式中，pCas9的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，pTT7的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，pTTD的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，pTDA的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术的第三个目的是提供上述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种生产L-苏氨酸的方法，将上述的重组大肠杆菌于35-38℃、200-220rpm条件下培养5-8h，10-20％的接种量接种发酵培养基，35-38℃、200-220rpm条件下培养10-14h，0.05-0.1mMIPTG诱导45-50h。本专利技术的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品及食品工业中的应用。本专利技术是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为强启动子T7；敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，减少发酵过程苏氨酸的代谢消耗；替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，削弱赖氨酸的合成。最终得到积累L-苏氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到30g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸奠定了基础。本专利技术提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。附图说明图1：质粒图谱，A：pTT7；B：pTTD；C：pTDA。图2：重组大肠杆菌CICC20905-THR以不同的碳源、氮源发酵生产L-苏氨酸。图3：重组大肠杆菌CICC20905-THR在50L发酵罐中发酵生产L-苏氨酸。图4：仅替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。图5：敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。图6：仅替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。具体实施方式(一)摇瓶水平的种子培养基及发酵培养基：平板培养基(g/L)：蔗糖1，Beef10，peptone10，NaCl5，Aga本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产L‑苏氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。

【技术特征摘要】
1.一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是替换了高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。5.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)构建T7启动子替换重组片段、苏氨酸脱氢酶敲除片段以及二氢吡啶二羧酸合成酶起始密码子替换重组片段：将大肠杆菌高丝氨酸激酶编码基因thrB起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T71；将苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB上下游同源臂序列融合后，得到片段TD2；将二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子上下游同源臂序列进行融合后，将起始密码子ATG替换为GTG，得到片段DA3；2)构建重组质粒：分别将片段T71、TD2、DA3与含sgRNA的线性化载体连接；分别得到含T71的重组质粒、含TD2的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈泰驰，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32