一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程领域。本发明专利技术通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶菌株，将重组菌株摇瓶发酵，以L‑Asp‑Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L‑丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，催化效率高，终产物L‑丙氨酸产率96％以上，简化产物的分离纯化步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一种产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌及其应用，属于生物工程

技术介绍
L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风格；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差，合成路线长，收率低，成本高，环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L。另一种方法使生物酶法合成L-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonassp.ATCC19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活很低。因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一株重组来源于不动杆菌(Acinetobactersp.ACNIH2)的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的大肠杆菌，并以该重组大肠杆菌为催化剂，利用全细胞催化法生产L-丙氨酸。本专利技术的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，异源表达了不动杆菌(Acinetobactersp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述Acinetobactersp.ACNIH2来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，以pET28a(+)为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述不动杆菌来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd与表达载体连接，转入大肠杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)合成核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd；(2)将克隆出的基因连接到pET28a(+)，构建成为重组质粒pET28a-Asd；(3)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-AbAsd。本专利技术的第三个目的是提供一种生产L-丙氨酸的方法，是应用上述大肠杆菌重组菌参与转化反应。在本专利技术的一种实施方式中，以含L-天冬氨酸的物质作为底物，以权利要求1-4任一所述的大肠杆菌重组菌为全细胞催化剂。在本专利技术的一种实施方式中，利用所述大肠杆菌作为全细胞催化剂催化L-天冬氨酸转化生产L-丙氨酸的反应条件为：调整温度为35-38℃，L-天冬氨酸钠以800-1000mmol/L的终浓度加入到OD600为8-20的菌液中，缓冲液为40-60mmol/LCH3COOH/CH3COONa缓冲液。本专利技术的第四个目的是提供一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第五个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在制药、化工或食品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L-天冬氨酸β-脱羧酶菌株，重组L-天冬氨酸β-脱羧酶的纯酶比酶活为4100U/mg；将重组菌株进行摇瓶发酵，以L-Asp-Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L-丙氨酸，L-丙氨酸的浓度为960mmol/L，L-丙氨酸产率为96％，简化了产物的分离纯化步骤，发酵周期短，生产效率高。附图说明图1：Ab-Asd的基因片段的核酸电泳验证结果，其中M为DNA分子量标准(250-10000bp)，1为L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因片段。图2：重组质粒pET28a-AbAsd的图谱。图3：AbAsd蛋白表达的SDS-PAGE验证结果，M：为蛋白分子量标准(20-200kDa)；1：大肠杆菌BL21pET28a-AbAsd重组菌诱导后的细胞破碎液上清。图4：全细胞催化生产L-丙氨酸示意图。图5：异源表达Pseudomonassp.ATCC19121来源的Asd得到的重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶和异源表达来源的Asd得到的重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活比较。具体实施方式(一)细胞密度UV-1800PC型紫外可见分光光度计测量OD600，根据吸光值和OD的关系换算，换算关系：1g/L＝0.3683OD600。(二)酶活的定义和检测方法酶活的定义(U)：每分钟转化L-天冬氨酸生成1mmol/LL-丙氨酸所需的酶量定义为1U。比酶活(U/mg)：每毫克Asd的酶活。(三)天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL0.1mol/LPITC乙腈溶液和250μL1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为LaChromC18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。(四)亲和层析柱HisTrapFF纯化蛋白的方法将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/LNa2HPO4、50mmol/LNaH2PO4、500mmol/LNaCl、20mmol/Limidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的HisTrapHP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，异源表达了不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)来源的L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶。

【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，异源表达了不动杆菌(Acinetobactersp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主。3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以pET28a(+)为表达载体。4.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，表达了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因。5.权利要求1-4任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd与表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘中美，周丽，崔文璟，郭军玲，于佳印，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32