一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将硫酸软骨素AC裂解酶进行异源表达，选取信号肽amyQ，采用自行构建的pHA03载体，通过乳糖或异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现了硫酸软骨素AC裂解酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素AC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子透明质酸的高效连续生产。本发明专利技术以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子透明质酸提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid，HA)，又名玻尿酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖；每个双糖单位通过件β-(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来；其双糖单位可达25000个之多，分子量在20000～50000kDa之间。透明质酸具有高度粘弹性和可塑性，超强的持水性和渗透性以及良好的生物相容性，被广泛应用于医学、药物、化妆品和食品等领域。透明质酸的粘弹性在关节腔内所起到的润滑、缓冲势作用及在结缔组织中充当填料的生物学功能之外，它还通过作用于细胞及细胞间质中的透明质酸受体，调节细胞功能，在组织生成和修复、肿瘤侵袭等过程中发挥重要作用。目前工业生产透明质酸的方法通常包括组织提取和微生物发酵等，虽然工艺不同，但透明质酸分子量一般为20000～50000kDa，此类透明质酸因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了透明质酸的疗效。因此，制备小分子透明质酸具有重要意义。小分子透明质酸的制备方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子透明质酸的研究热点。硫酸软骨素裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将透明质酸降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSaseAC,ChSaseAC,ChSaseAC和ChSaseC。硫酸软骨素裂解酶产生菌如表1所示，其中肝素黄杆菌Flavobacteriumheparinum是ChSaseAC的主要来源。表1硫酸软骨素裂解酶产生菌目前，虽然ChSaseAC重组菌已经构建，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSaseAC以包涵体的形式存在。此外，小分子量透明质酸一般用于医药和食品领域，而大肠杆菌表达的ChSaseAC并不适用于小分子量透明质酸的制备。国内对于ChSaseAC的发酵生产主要的问题是：发酵生产ChSaseAC酶活偏低，且多为胞内表达，而破碎过程必定会增加生产成本。因此，构建以分泌型生产ChSaseAC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意义。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是，提供一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的基因工程菌及其构建方法，实现硫酸软骨素ABC裂解酶的分泌表达，以解决现有技术中硫酸软骨素ABC裂解酶表达量少、酶活低、存在包涵体等问题。本专利技术还要解决的技术问题是，提供上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的基因工程菌在发酵制备硫酸软骨素ABC裂解酶中的应用。本专利技术最后要解决的技术问题是提供一种一步法高效小分子透明质酸的方法，通过设计的硫酸软骨素裂解酶-酶膜反应器实现了小分子透明质酸的一步法高效连续生产，并将昂贵的硫酸软骨素裂解酶循环利用，大大降低了生产成本。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB600-△spoOA或者B.subtilisWB800-△spoOA。上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1S)将SEQIDNO.1所示的基因序列克隆到表达载体上，得到重组质粒，所述表达载体为pHA03；(2S)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，既得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶或小分子透明质酸中的应用。一种小分子透明质酸的制备方法，包括如下步骤：(1)透明质酸的制备：包括组织提取法和生物合成法；(1-1)组织提取法：(1-1a)动物组织预处理：将动物组织放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为70～95℃，加热1～2h，除去上层油脂，得到软骨处理液；(1-1b)酶解：用NaOH调节软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，使中性蛋白酶和胰蛋白酶的总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，继续酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；酶解完成的确定：将0.5mol/L三氯乙酸滴加到酶解液中观察酶解液的混浊程度，酶解液不混浊或显微混浊，则证明酶解完成；(1-1c)过滤：过滤步骤(1b)得到的混合液A，收集滤液，得到透明质酸溶液；(1-2)微生物发酵法：(1-2a)透明质酸的生物合成将兽疫链球菌接种至接种至发酵培养基中，在发酵罐中培养，具体培养方法如下：将培养好的斜面种子兽疫链球菌(S.zooepidemicus)接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，37℃，200rpm，过夜培养。按8％的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐(BioFlo115,NewBrunswickScientific,USA)中，装液量为4.5L，搅拌转速400r/min，通气量1.0vvm，温度37℃，发酵18～20h，发酵罐中透明质酸发酵培养基配方为：酵母粉10g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸钠2g/L，蔗糖60g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙0.002g/L,氯化锌5×10-5g/L，硫酸铜2×10-5g/L，pH7.0；(1-2b)过滤：向发酵液中加体积分数为1‰～5‰的高岭土或者硅藻土，搅拌0.5～1h后用板框过滤机过滤除菌，得到含有透明质酸的滤液。(2)吸附：将步骤(1-1c)或(1-2b)得到的透明质酸溶液分别泵入透明质酸专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了透明质酸的层析柱；吸附完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的吸附穿透液中，或将CPC滴加到吸附液中，若无透明质酸析出或溶液没有变浑浊，即吸附完成。(3)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(2)得到的吸附了透明质酸的层析柱进行除杂处理；除杂完成的确定方法：除杂穿透液中蛋白质浓度小于1‰时，除杂完成；(4)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对吸附了透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600‑△spoOA或者B.subtilis WB800‑△spoOA。

【技术特征摘要】
1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB600-△spoOA或者B.subtilisWB800-△spoOA。2.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1S)将SEQIDNO.1所示的基因序列克隆到表达载体上，得到重组质粒，所述表达载体为pHA03；(2S)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，既得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。3.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶或小分子透明质酸中的应用。4.一种小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)透明质酸的制备：包括组织提取法和生物合成法；(1-1)组织提取法：(1-1a)动物组织预处理：将动物组织放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为70～95℃，加热1～2h，得到软骨处理液；(1-1b)酶解：用NaOH调节软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，使中性蛋白酶和胰蛋白酶的总酶活与软骨质量的比例为2×105～6×105U：1kg，继续酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；(1-1c)过滤：过滤步骤(1b)得到的混合液A，收集滤液，得到透明质酸溶液；(1-2)微生物发酵法：(1-2a)透明质酸的生物合成将兽疫链球菌接种至接种至发酵培养基中，在发酵罐中培养；(1-2b)过滤：向发酵液中加体积分数为1‰～5‰的高岭土或者硅藻土，搅拌0.5～1h后用板框过滤机过滤除菌，得到含有透明质酸的滤液。(2)吸附：将步骤(1-1c)或(1-2b)得到的透明质酸溶液分别泵入透明质酸专用吸附层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了透明质酸的层析柱；(3)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(2)得到的吸附了透明质酸的层析柱进行除杂处理；(4)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对吸附了透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有透明质酸；(5)脱盐：将步骤(4)得到的洗脱液A用孔径为100kDa～300kDa的超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；(6)透明质酸的连续降解：将步骤(5)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的降解反应釜13中，向其中加入硫酸软骨素AC裂解酶，使硫酸软骨素AC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为2×105～6×105U：1kg，控制转速50～100rpm，温度25～40℃，降解反应进行1h后，开启酶膜反应器的超滤膜组件，小分子透明质酸透过超滤膜进入酶膜反应器的浓缩釜中，得到小分子透明质酸浓缩液；(7)除菌：对小分子透明质酸浓缩液进行除菌处理，得到无菌滤液；(8)浓缩：将步骤(7)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；(9)干燥：将步骤(8)得到的无菌浓缩液泵入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子透明质酸成品。5.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的酶膜反应器包括如下部件：各单元通过管道连接，主体部分包括降解反应釜(10)、超滤膜组件、浓缩釜(13)和纳滤膜组件14；其中，所述降解反应釜(10)包括：夹套(8-1)、搅拌桨(9-1)、电机(2-1)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凌天，徐悦，杜悦，朱益波，丁高杰，杨兴旭，王成红，杨蕾，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32